曾 東 牛 嬌 李長義 常 津 牛光良▲
1.北京市中西醫結合醫院口腔科,北京 100039;2.山西醫科大學第二醫院口腔科,山西太原 030001;3.天津醫科大學口腔醫院院辦,天津 300070;4.天津大學生命科學學院納米醫學研究所,天津 300072
口腔臨床中,無痛治療觀念的普及使局麻藥的應用非常廣泛,且以局部注射麻醉為主,幾乎很少應用口腔表面麻醉劑。表面麻醉劑具有無痛、無損傷等優點[1],更符合無痛治療理念。但是,現有商品化的表面麻醉劑普遍存在起效慢、作用表淺、麻醉效果不佳等缺點[1-2],開發滲透力強、起效快、麻醉效果好的表面麻醉劑成為倍受關注的研究方向之一[3-4],尤其以脂質體為載體的透皮給藥系統為近年來新的研究方向[2]。
本課題組與天津大學材料學院納米生物技術研究所自主研發了新型表面麻醉劑-載鹽酸利多卡因葡聚糖基納米高分子脂質體(Lidocaine hydrochloride lysine-linoleic acid modified dextran polymeric lipid vesicles,LID-LLD-PLVs),是以賴氨酸、亞油酸、葡聚糖和膽固醇合成的葡聚糖基納米高分子材料為載體,包載利多卡因(Lidocaine,LID)合成[5],各項理化性能良好[5],并具有優越的透皮性能,可有效增加利多卡因的透皮量和滲透深度[6]。為了探討其口腔黏膜表面麻醉作用機制,本研究以家兔下頜前牙唇側牙齦為給藥部位,通過實時熒光定量PCR(real-time PCR)對牙齦、三叉神經節和延髓中P 物質(substance P,SP)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)和即刻早期基因(c-fos)進行了mRNA 定量分析對比。
1.1.1 材料與試劑
LID-LLD-PLVs,天津大學材料學院納米生物技術研究所實驗室自制;Trizol,批號15596-026,Invitrogen生物科技公司;DEPC 處理水,批號BYL40387 上海基爾頓生物公司;異丙醇HPLC 級,上海國藥集團;無水乙醇AR 級,上海國藥集團;SYBRGreen PCR 試劑盒,批號F-415XL,反轉錄試劑盒,批號K1622,Thermo 科技有限公司。
1.1.2 儀器與設備
Real-time PCR 儀,ABI-7300,ABI 公司;旋渦振蕩器,XW-80A,上海青浦瀘西儀器廠;手握式電動勻漿機,F6-10,德國FLUKO;低溫冷凍離心機,Sigma;移液器,吉爾森P 型移液器,3K15。
1.1.3 實驗動物
新西蘭兔24 只,健康、口頜系統無異常,8 月齡,雌雄、顏色不限,體重(2.0±0.2)kg,購于北京隆安實驗動物養殖中心,生產許可證號:SCXK(京)2014-0003,動物質量合格證號:No.11401400000479。常溫普通飼料飼養1 周。本實驗經天津醫科大學藥物實驗倫理委員會批準。
1.2.1 實驗分組及給藥
將24 只家兔按體重分層隨機分組法分為4 組,每組6 只,為空白對照組(不給藥)、LID-LLD-PLVs 30 min、60 min 和90 min 組,給藥方法為下頜前牙唇側牙齦表面涂抹LID-LLD-PLVs 0.5 mL 30、60 min和90 min。
1.2.2 樣本采集
將家兔固定在手術臺上,體位選取仰臥位,麻醉方式為全麻,給藥途徑為經耳緣靜脈,麻醉劑選擇20%烏拉坦,給藥劑量為3 mL/kg。按“1.2.1”給藥,然后同位置注射10%福爾馬林溶液25 μL。1 h 后,靜脈注射空氣致死,取給藥區牙齦,放入液氮速凍保存待測[7]。然后沿顱頂正中線做切口,長度40~50 mm,分離骨膜,暴露前囟、人字縫和矢狀縫,確定開顱位置,咬骨鉗去除部分顱骨,暴露給藥同側三叉神經節和延髓,取出放入液氮中速凍保存待測。每組兔子均進行樣本采集[7]。
圖1 延髓的取出
1.2.3 應用Real-time PCR 方法對牙齦、三叉神經節和延髓中SP、CGRP 和c-fos 進行mRNA 定量分析
1.2.3.1 總RNA 的抽提 取各組織100 mg 加入1 mL預冷Trizol;勻漿30~45 s(轉速8000 r/min),后移至無RNA 酶的離心管中,室溫放置5 min 后加入預冷的氯仿(200 μL 氯仿/1 mL Trizol),劇烈振蕩15 s,室溫放置10 min 后離心15 min(4℃,8000 r/min,12 000 g);小心吸出上層水相500 μL 轉移至無RNA 酶的離心管中,加入等體積異丙醇顛倒混勻6~8 次,-20℃冰箱放置30 min,然后離心15 min(4℃,8000 r/min,10 000 g),可見RNA 沉淀;棄上清,650 μL 75%乙醇洗滌沉淀,離心5 min(4℃,8000 r/min,離心半徑10 cm),棄上清,重復洗滌1 次,棄上清,吸凈殘存乙醇,自然干燥5~10 min,20 μL DEPC 處理水,溶解RNA,-80℃冰箱保存待用[7]。
1.2.3.2 逆轉錄cDNA 將試劑盒從-80℃冰箱取出復溶,將5×逆轉錄buffer、dNTPs、MMLV、oligo(dT)10 000 r/min 數秒[7]。反應體系為:5×逆轉錄buffer 4 μL,oligo(dT)0.5 μL,dNTPs 0.5 μL,逆轉錄酶MMLV 1 μL,DEPC 處理水10 μL,RNA 模板4 μL,總體積20 μL。反應條件:37℃1 h;95℃5min。滅活MMLV[7]。
1.2.3.3 real-time PCR 擴增 擴增體系為:SYBRGreen Mix 32.5 μL,上游引物F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,ddH2O 水14.5 μL,cDNA 模板2 μL,總體積50 μL。條件:95℃10 min,95℃15 s,60℃45 s,40 循環[7]。溶解曲線:95℃15 s,60℃1 min,95℃15 s,60℃15 s[7]。引物序列:SP,正向引物:5’-TGCCGCTTCATTTATGTC-3’;反向引物:5’-ACACTGTGCTTTGTTGAG-3’。CGRP,正向引物:5’-TGGGCTTCCTCAAGTTCTCC-3’;反向引物:5’-TCTGTCTCCTGCTGCTGTTC-3’。c-fos:正向引物:5’-CTGAGGATGGTGGAGTTG-3’;反向引物:5’-CACGAGAGTGAGGATGAG-3’。GAPDH,正向引物:5’-CTCCTGCGACTTCAACAGTG-3’;反向引物:5’TGAGGGCTCTTACTCCTTGG-3’。
采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析計算SP、CGRP 和c-fos 的mRNA 絕對定量值。采用統計學軟件SPSS 17.0 對數據進行分析,計量資料采用均數±標準差()表示,多組比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。
SPmRNA 定量統計分析結果:LID-LLD-PLVs30min組牙齦的SP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 60 min,90 min 組,LID-LLD-PLVs 60 min 組低于LIDLLD-PLVs 90 min 組,各LID-LLD-PLVs 組均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);LID-LLD-PLVs 30 min、60 min 和90 min 三組延髓和三叉神經節中的SP mRNA 定量比較,差異無統計學意義(P>0.05),但都低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2A。
CGRP mRNA 定量統計分析結果:LID-LLDPLVs 60 min 組牙齦的CGRP mRNA 定量低于LIDLLD-PLVs 30 min、90 min 組,LID-LLD-PLVs 30 min組低于LID-LLD-PLVs 90 min 組,差異有統計學意義(P<0.05);LID-LLD-PLVs 90 min 組與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。LID-LLD-PLVs 30 min組延髓中CGRP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 60 min 和90 min 組,LID-LLD-PLVs 各組均低于對照組。LID-LLD-PLVs 60 min 組三叉神經節中CGRP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 30 min 和90 min組,各LID-LLD-PLVs 組均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2B。
c-fos mRNA 定量統計分析結果:LID-LLD-PLVs 30 min 組牙齦的c-fos mRNA 定量與LID-LLD-PLVs 60 min 組和90 min 組比較,差異無統計學意義(P>0.05),但均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。LID-LLD-PLVs 60 min 組延髓的c-fos mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 30 min 和90 min 組,LID-LLDPLVs 各組均低于對照組。LID-LLD-PLVs 60 min 和90 min 組三叉神經節中c-fos mRNA 定量低于LIDLLD-PLVs 30 min 組,各LID-LLD-PLVs 組均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2C。
圖2 各組家兔牙齦、三叉神經節和延髓中SP、CGRP 和c-fos 的mRNA 定量(,n=6)
口頜面部疼痛的產生和傳遞主要由三叉神經介導。當口頜面部受到外界刺激,包括各種物理、化學刺激,伸入口頜面部組織內的初級感覺神經元的外軸突(位于三叉神經傳入纖維內)將信息上傳至胞體,胞體位于三叉神經節內。初級感覺神經元的中樞突與延髓內的三叉神經脊束核相連,完成外周信息向三叉神經脊束核的傳導,之后繼續上傳,到達腦中樞,完成初級感覺信息的傳導。痛覺信息的產生、傳遞過程非常復雜,很多物質參與其中,在信息的傳遞與調節過程中起著至關重要的作用,通常將這類物質叫做神經遞質[7,9-10]。已有研究顯示,與口頜面部疼痛相關的物質有SP、CGRP、c-fos 基因等[6-7,11-12]。SP 和CGRP 屬于肽類神經遞質,在口腔頜面部疼痛機制研究中涉及較多,以往的研究[13-14]多集中在牙髓炎[15]、牙周炎[16]、正畸[17]加力引致的疼痛等方面,c-fos 的研究相對較少。而關于局麻藥對SP、CGRP 和c-fos 等物質表達的影響,幾乎沒有相關研究。
SP 是最早被研究者發現的肽類神經遞質[16],也是最早在牙髓中發現的神經肽,它在組成結構上含有11 個氨基酸。CGRP 是1983 年由Lénárd 等[18]發現的一種由37 個氨基酸組成的生物活性多肽。二者均由三叉神經節細胞合成并釋放輸送至延髓和牙髓、牙周組織等部位[21]。SP 通過擴張血管、產生內源性致痛物質而致痛[22]。CGRP 存在范圍較廣,其釋放量與疼痛程度成正相關,即疼痛程度越強,它的釋放量越大。CGRP對SP 有正、反雙向調控作用,包括增加SP 的釋放[22]和傳導,降低降解速度[22],延長衰變等調控達到加強痛覺傳導的作用[7]。c-fos 基因[23-24]是一種即刻早期基因,無疼痛刺激時,c-fos 基因不表達,受到刺激后,迅速表達,所以在疼痛的早期即可在生物體內出現[25],有部分研究者在頜面部炎性疼痛的研究中,把三叉神經脊束核的神經元內c-fos 表達水平作為判斷刺激強度的指標[26]。
以往研究結果認為,在疼痛信息的產生、傳遞與調節過程中,因為刺激種類、部位不同,參與的神經遞質及表達亦不同[7]。本研究應用福爾馬林對牙齦致痛,對照組牙齦、三叉神經節和延髓內SP、c-fos、CGRP 均出現了高表達,證實了疼痛會誘發機體釋放這幾種神經遞質。應用LID-LLD-PLVs 后再以福爾馬林在牙齦致痛,牙齦、三叉神經節和延髓內SP、CGRP 和c-fos均有不同程度的表達降低,且在90 min 內作用未消失,推測LID-LLD-PLVs 對疼痛信息的傳遞起到了抑制作用,且作用時間>90 min,肯定了其藥效的持久性。但在不同部位的相同時間、或同一部位的不同時間mRAN 的表達影響未發現一致性規律。分析原因可能是:神經遞質的合成、釋放兩種行為同時發生,最終的表達量取決于這兩種行為相互抵消的結果。當傷害性刺激產生時,神經遞質在不同部位及不同時間的表達并不一致,表現為合成速度和釋放速度的不同,且不是維持在定量水平,而是處在動態變化中,最終的表達量往往是不可預測的。而且即使在同一個部位,參與疼痛傳遞的神經遞質也不是唯一的,有部分因子已有研究證實,但是可能還包括很多未知因子,他們均可能對那些已知因子包括本研究涉及的SP、CGRP 和c-fos 的表達造成影響。另外在本實驗中,家兔于全麻下完成實驗,個體間麻醉深度的差異也可能影響SP、CGRP 和c-fos 的表達。所以,未來實驗方向可以為進一步確定是否有起決定性作用的某一神經遞質存在,并作為評價同類藥物作用機制的標準。