板藍根多糖在結核大鼠模型中對Th細胞的干預作用

田 冰 樊安蓮 劉 璟

(1.重慶大學附屬三峽醫院感染科 重慶 404000；2.重慶三峽醫藥高等專科學校醫學基礎部免疫教研室重慶 404000)

結核病由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， M T B）感染造成，近年結核罹患率上升，結核患者年輕化，結核治療難度加大[1]。研究證實，結核病的病程與患者體內Th細胞漂移關系密切，結核病本身是感染、抗感染免疫和超敏反應的三位一體，其組織損傷多由病理性免疫反應造成，而臨床治療主要使用國標抗結核配伍，對免疫調節重視不足。目前國內有不少中藥干預結核免疫的研究，如貓爪草、狼毒大戟等[2][3]，因中藥干預具免疫調節機制而備受重視，但體內實驗開展較少，缺乏相關經驗可借鑒。板藍根多糖是中藥板藍根提純的多糖成分，近年研究顯示其在感染、腫瘤等疾病中有突出的免疫調節效應[4][5]，故而本研究選定板藍根多糖為干預藥物。本研究建立結核大鼠模型，以癥狀評估及相應檢查為標準，探討板藍根多糖應用于結核治療的可行性。研究情況介紹如下。

一、資料和方法

（一）實驗模型資料

健康SPF級大鼠60只，體重200（±20）克，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號SCXK(川)2013-24，各組間體重和性別差異無統計學意義，10只為對照組，50只大鼠經尾靜脈接種標準菌株H37RV混懸液建造動物模型。

1.造模方法

參考呂艷文獻[6]，將經大鼠體內接種毒力復蘇的菌種轉種改良羅氏培養基，37℃培養20天，取干菌落加滅菌生理鹽水研磨成菌懸液，比濁法測定菌懸液濃度為3×107/ml，經尾靜脈注射0.2ml菌懸液，接種前后常規喂養。

2.造模評估

根據盧振方等研究經驗[7][8]，接種菌株后主要根據兩方面情況評判造模結果：大鼠臨床表現：1.臨床癥狀：毛發脫落、進食減少、體重減輕、精神萎靡、活動度降低等；2.實驗室檢查：肺泡灌洗液查結核分枝桿菌陽性。

3.動物模型分組、干預處理及干預效果評估標準

根據造模標準判定造模成功40只，隨機選其中10只設定為模型組，其余30只為干預組。干預組大鼠確認造模成功后分別予板藍根多糖100mg.kg.d，200mg.kg.d，300mg.kg.d腹腔注射，觀察三組大鼠臨床表現，根據大鼠癥狀表現及造模評判，干預效果評估標準設置如下：進食（＞50g/d為正常，30～40/d為減弱，＜30g/d為嚴重。），精神狀態（精神好，對刺激反應敏捷為正常，精神稍差，對刺激有反應為減弱，精神萎靡，刺激反應遲鈍為嚴重），毛發情況（茂密無脫落為正常，少量脫落為減弱，大量脫落為嚴重），體重（變化＜5%為正常，5%＜變化＜10%為減弱，變化＞10%為嚴重），正常3分、減弱2分、嚴重1分，采取分數疊加制，10-12分為顯效，6-9分為有效，3-5分為無效。造模成功后20天和30天各抽一次大鼠外周血，流式細胞術檢測Th細胞亞群表型，ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-10。

（二）菌種、試劑及藥品

結核分枝桿菌H37RV菌種由中國疾控中心重慶結核病預防控制分中心提供，-80℃低溫保存，常規傳代。ELISA試劑盒購自武漢華美科技有限公司，IFN-γ試劑盒（CSB-E04579r），IL-4試劑盒（CSB-E04634m），IL-10(CSB-E07451r)，嚴格按說明書低溫保存并使用。板藍根多糖由重慶三峽醫藥高等專科學校抗腫瘤天然藥物研究工程中心自行提取，純度為85%。超低溫冰箱（海爾，DW-86L286)，電子天平（上海越平FA1004B），生物安全柜（蘇州安泰，BSC-1000ⅡA2），酶標儀（芬蘭，Multiskan MK3），流式細胞儀為貝克曼庫爾特臨床分析型三激光流式細胞儀DXFlex，顯微鏡用奧林巴斯顯微鏡CX31-LV320。

（三）大鼠肺指數測算

肺指數可表現出肺部炎癥情況的嚴重程度，三組大鼠處死后，取出肺臟進行稱重，按肺指數計算公式，肺指數=肺重量（g）×100/體重（g），計算得三組大鼠肺指數并進行比較。

（四）數據處理

癥狀比較用例數表示，肺指數、T細胞亞群及細胞因子檢測數據以均數±標準差表示，干預組大鼠癥狀表現用卡方檢驗，肺指數比較用單因素方差分析，干預組肺指數組間比較用兩兩比較，T細胞亞群及細胞因子檢測結果各組間數據比較用析因分析，析因設計統計組間差異性仍然要用方差分析，以P＜0.05差異有統計學意義。數據處理用統計學軟件SPSS16.0。

二、結果

（一）三組大鼠癥狀表現

接種菌株之后，模型組和干預組大鼠于第8天左右出現毛發脫落、沒有光澤，進食減少、體重減輕，活動度降低、精神狀態差、給予刺激反應也比較慢。干預組大鼠經板藍根多糖干預后，第20天和第30天測體重基本未再減輕，進食如常，毛發不再脫落，精神好，給予刺激反應正常。期間沒有大鼠死亡。干預組大鼠模型中癥狀表現具體情況為300mg.kg.d組顯效4例，有效6例，無無效案例，200mg.kg.d組顯效4例，有效6例，無無效案例，100mg.kg.d組顯效2例，有效8例，無無效案例。期間觀察干預組大鼠治療效果與干預劑量正相關（P＜0.01）。

（二）三組大鼠肺重量指數比較

三組大鼠處死后，取出肺臟進行稱重，按公式計算得三組大鼠肺指數及比較情況，健康組大鼠肺指數為0.55±0.13，模型組大鼠肺指數3.59±1.12，100mg.kg.d組肺指數2.67±1.06，200mg.kg.d組肺指數2.14±0.72，200mg.kg.d組肺指數1.93±0.69，與健康對照組相比，干預組大鼠肺指數仍有升高，P＞0.05；與模型組相比，干預組大鼠肺指數明顯降低P＜0.01；隨給藥劑量，干預組肺指數有所降低，組間兩兩對比，肺指數差異有統計學意義，P＜0.01。

（三）三組大鼠Th細胞表型及表達情況檢測

三組大鼠外周血檢查，對照組CD4 37.12±5.86，CD8 18.43±2.24，CD4/CD8 2.11±0.45；模型組CD4 20.27±5.08，CD8 21.45±2.46，CD4/CD8 1.13±0.31；經干預后，100mg.kg.d組CD4 32.69±6.23，CD8 19.59±2.22，CD4/CD8 1.72±0.22，200mg.kg.d組CD4 36.07±5.14，CD8 19.08±2.23，CD4/CD8 1.89±0.28，300mg.kg.d組CD4 36.42±5.22，CD8 18.82±2.34，CD4/CD8 1.94±0.29，干預組大鼠檢測Th細胞亞群接近健康對照組，與模型組和對照組比較差異均具有統計學意義（P＜0.001）。

（四）三組大鼠細胞因子檢測結果

干預組大鼠在造模成功20天開始出現IFN-γ、IL-10輕微降低，IL-4未明顯降低，造模成功30天后，干預組大鼠外周血IFN-γ、IL-10明顯降低，IL-4輕微降低，與模型組及對照組相比較差異均具有統計學意義（P＜0.001），數據如下表1。

表1 三組大鼠細胞因子檢測結果（±s，pg/ml）

表1 三組大鼠細胞因子檢測結果（±s，pg/ml）

lFN-γ lL-4 lL-10對照組101.57±5.33 50.16±4.82 31.96±4.39 20天61.15±4.88 75.31±6.07 80.84±5.71模型組30天61.37±4.92 75.42±6.21 81.97±5.44 20天81.79±5.62*69.67±5.99**50.16±5.77***100mg.kg.d組30天82.73±5.31*64.72±6.02**52.85±4.98***20天90.64±5.16*67.54±6.19**42.32±5.41***200mg.kg.d組30天95.13±5.67*63.49±6.18**41.56±4.62***20天96.67±5.17*66.69±6.18**40.73±5.33***300mg.kg.d組30天100.73±4.99*61.74±5.78**39.79±4.72***F 241.27 58.58 594.78 P 0.001 0.001 0.001

*F值59.35，P＜0.001，**F值8.33，P＜0.001，***F值30.30，P＜0.001。這三組數據的比較反映出板藍根多糖干預效果與板藍根多糖用量正相關。

（五）三組大鼠病理學檢查結果

造模30天后處死大鼠，模型組大鼠病灶在鏡下可見肺部基礎結構破壞較嚴重，有干酪樣壞死，大量炎細胞浸潤，較多郎罕氏巨細胞和上皮樣細胞，有典型結核結節；干預組大鼠鏡下觀肺部基礎結構損傷較小，炎性浸潤較輕，上皮樣細胞減少而纖維母細胞增多。

三、討論

結核病傳播方式多樣，侵犯部位多樣，可通過結核分枝桿菌產生的脂類和蛋白類物質引起機體超敏反應，在結核病的病程中，感染、免疫和超敏反應是一個復雜的共同作用而又相互影響的整體效應。結核病的病理損傷也多因超敏反應及炎癥損傷所致。研究證實，結核病病程與Th細胞漂移及Th細胞分泌的細胞因子密切相關。在近年來的研究中，板藍根多糖在感染、腫瘤等疾病中有突出的免疫調節效應，故而選定為干預藥物。鑒于此前研究缺少相關經驗可借鑒，本研究大部分評估為根據治療經驗自行設置。

研究參照前人研究建立大鼠結核模型，以癥狀和影像學檢查為造模判定標準，并設置癥狀表現評估標準。接種菌株后，大鼠于第8天左右開始出現不同程度進食、體重、精神狀態的變化，結合預設判定標準，成功造模40只，成功率為80%。干預組大鼠確認造模成功后隨機分三組，分別予板藍根多糖100mg.kg.d，200mg.kg.d，300mg.kg.d治療。在進行板藍根多糖干預后20天左右，干預組大鼠體重逐漸穩定，精神狀態也有所好轉。繼續觀察至30天，根據預設癥狀評估標準，板藍根多糖干預組大鼠癥狀較模型組大鼠緩解。病理檢查顯示，未經處理的模型組大鼠肺部基礎結構破壞嚴重，大量炎細胞浸潤，可見干酪樣壞死和大量上皮樣細胞、郎罕氏巨細胞，為典型結核結節，而經板藍根多糖干預的大鼠肺部基礎結構尚存在，炎性浸潤較輕，上皮樣細胞少而纖維母細胞多，顯示病灶有纖維化趨勢。結合癥狀表現評估和病理檢查，說明板藍根多糖在結核大鼠模型中可干預過度的炎癥病程，減少肺組織炎性病理損傷，對結核干預有積極作用。

臟器感染MTB后，由于MTB的病理性炎癥反應，臟器重量會增加，其重量與病理變化正相關。研究結果表明，在進行板藍根多糖干預后，干預組大鼠肺重量指數較模型組大鼠小，雖然未恢復至正常，但已說明板藍根多糖對MTB感染大鼠的病程有積極作用。

多數研究認為，結核免疫病程與Th細胞活化失衡及Th細胞漂移有關。Th細胞是人體免疫調節細胞的主力，主要靠分泌細胞因子發揮作用。IFN-γ主要由Th1細胞分泌，具活化巨噬細胞功能，可調節炎癥免疫效應，是機體抗結核免疫中的關鍵因子。在既往研究中，證實由于Th細胞漂移，外周血IFN-γ在結核不同的病程期有不同的濃度，其濃度與活動性結核分枝桿菌數量有關。在本研究中，造模成功后，外周血CD4Th細胞降低，CD8T細胞輕微升高，CD4/CD8出現比例失衡，IFN-γ表達隨之降低，符合前人研究。使用板藍根多糖干預后，CD4Th細胞逐漸上升，CD8T逐漸接近健康對照組水平，CD4/CD8隨之接近正常組，IFN-γ逐漸上升，其升高程度與干預藥量正相關，結合癥狀評估結果，應當是板藍根多糖干預了Th細胞的表型分化，恢復細胞免疫平衡，IFN-γ表達逐漸正常，促進巨噬細胞抗MTB，使結核病程得到控制，活動性MTB減少。IL-4、IL-10主要由Th2細胞分泌，可調節IFN-γ分泌和效應，避免結核病程中過度炎癥反應造成的病理損傷，在結核病中具免疫保護作用。過低的IL-4被認為是結核嚴重炎癥病理損傷的原因。在本研究中，干預組大鼠的IL-4、IL10在造模成功及造模成功后20天升高，在經干預后30天降低至接近正常水平，結合大鼠模型的癥狀表現和病理檢查，可以認為在此次干預中，CD4/CD8保持在一個較合適的動態平衡中，既有利于結核的抗感染免疫，也可以起到避免病理損傷的作用。

四、結束語

板藍根多糖可通過對Th細胞表型及細胞因子表達的影響，對結核病程進行免疫干預，減輕病程中病理性炎癥反應，促進巨噬細胞的抗MTB作用，對結核病具積極作用。目前存在的問題是：板藍根多糖在抗MTB的過程中是否具有量效關系還不夠明確；板藍根多糖與其他抗MTB的藥物單獨作用效果比較和協同作用效果尚未驗證，還需進一步實驗證明。