分次灌膠制備二維凝膠電泳大膠①

徐胡斌,朱 茵,劉安敏,趙起超,2,謝 恬,2,陳功星,2③

(1.杭州師范大學醫學部,浙江 杭州 311121;2.浙產中藥材資源開發與應用浙江省工程實驗室,浙江 杭州 311121)

蛋白質組學是分子生物學的重要內容,二維凝膠電泳(2-DE)技術在蛋白質組學研究中得到了廣泛的應用,它能夠根據蛋白質的等電點和分子量,將蛋白質混合物中的不同蛋白分子分開,形成各自單獨的蛋白質分子點,從而能夠對蛋白質表達模式進行大規模分析,解讀他們在不同生物下的變化,二維凝膠電泳是分離蛋白的一種強大工具,常應用于蛋白質組學研究。盡管過去了幾十年,出現了更復雜和高性能的質譜分析方法,但只有結合二維凝膠電泳才使得它在蛋白研究領域發揮更大作用[1]。最近出現的熱細胞轉移技術(cellular thermal shift assay,CETSA)與2-DE結合成為新的技術手段,用于藥物蛋白靶標分析,在大腸癌細胞中找到了藥物的靶標分子丙酮酸激酶M2型(PKM2),為新藥開發提供新方法[2]。二維凝膠電泳技術在等電聚焦后的第二維凝膠電泳常在大膠中進行,但目前大膠制備時容易漏膠,導致制膠困難或膠板質量不高,影響實驗結果[3-4]。但目前大膠制備時容易漏膠,筆者在實驗過程中摸索出一種簡便的分次灌膠制膠法,有良好的制膠質量。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞株A549為本實驗室保存。細胞培養試劑RPMI1640、小牛血清購于杭州曜暉生物科技有限公司;制膠大玻璃板(25.5 cm×21 cm)、制膠立架、IPG干膠條(pH 3~10)及其相應試劑、聚焦儀、電泳儀、掃描儀均為美國GE(Ettan IPGphor 3)產品;蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒,購于上海碧云天生物有限公司;考馬斯亮藍染色液及其脫色液為實驗室自配。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及樣本制備 A549細胞培養于含10%小牛血清的RPMI1640(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml)細胞培養液中,置于37℃、飽和濕度和5%CO2孵育箱中培養;消化收集對數期生長細胞,參照美國GE(Ettan IPGphor3)使用說明,5×106個細胞混懸于10μl PBS中,然后,加入50μl細胞裂解液[9 M尿素、4%chaps、2%IPG緩沖液、40 mM的Tris-base(pH 8.8)、40 mM的DTT],冰浴,每隔2 min振蕩30 s,共10 min,然后,4℃、離心45 min,取上清20℃保存備用。

1.2.2 聚丙烯酰胺大膠制板 在250 ml廣口瓶中配制57 ml濃度為10%分離膠混合液,安置好長、短玻璃板,其兩邊上、中、下重疊部位分別用3個寬50 mm的長尾辦公夾夾住,置于制膠立架上。單次與分次灌膠各制備10塊大凝膠,單次灌膠為1次性灌注膠液,分次灌膠為分3次灌注膠液,前兩次各3 ml,每次灌膠凝固后,再往下繼續操作,第1次灌膠后會出現少量漏出,膠凝固后,第2次灌膠,未見漏出,待凝固后,底部可能的縫隙已全部堵住,可以進行最后1次灌膠。然后加0.1%的SDS液,將膠面壓平。膠凝固后,倒去上層壓膠液,用吸水紙吸干,大膠板配制完成。

1.2.3 聚焦電泳及染色掃描 從-20℃冰箱取出13 cm長的IPG干膠條,室溫平衡30 min,剝去保護膜,膠面朝下蓋住250μl水化液(8 M尿素、2%chaps、0.5%IPG緩沖液、15 mM的DTT,新鮮配制或者-20℃冰箱保存,不可反復凍融),室溫被動水化10 h。將IPG膠條膠面朝上轉移到聚焦儀的聚焦盤里,兩端覆蓋去離子水浸濕的電極濾紙,電極安裝到位,加礦物油確保膠條完全浸沒。安裝樣品杯,加入50μl提前制備好的樣品。電泳參數:250 V 20 min;4 000 V 2 h,4 000 V 2.5 h等電聚焦。取5 ml平衡液[6 M尿素、2%的SDS、0.375 M的Tris-HCl(pH 8.8)、20%甘油]置于試管中,加入二硫蘇糖醇50 mg,0.25%溴酚藍25μl,取出聚焦后的膠條浸泡,水平搖床搖15 min;然后膠條置于5 ml平衡液中,加入碘乙酰胺125 mg,0.25%溴酚藍25μl,搖15 min。將IPG膠條用電泳緩沖液輕輕浸洗,去除緩沖液,然后放入上述制備大膠的上端,并放置蛋白Marker浸泡的濾紙條,用5%低熔點瓊脂糖封閉;安裝電泳裝置,加好電泳緩沖液,恒定功率1 W,電泳過夜。最后取出凝膠浸泡于考馬斯亮藍染色液(50%甲醇、10%乙酸、0.05%考馬斯亮藍G250)中,搖動過夜,脫色液(甲醇 ∶雙蒸水 ∶乙酸=45∶45∶10)漂洗。打開掃描儀軟件LabScan,掃描凝膠并保存結果。

1.3 統計學方法

數據采用Excel表統計分析,計數資料以%表示,采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種灌膠方法分析

分次灌膠制10塊板,1次漏膠,成功率為90%;單次灌膠制10塊板,8次漏膠,成功率為20%,兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 大玻璃板制備聚丙烯酰胺凝膠板

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色掃描

大玻璃板聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳,IGP膠條長為13 cm,pH 3~10。藍色點為A549細胞的蛋白質分子電泳后的考馬斯亮藍染色圖譜,點型規范,分布自然;酸性蛋白質分子點居多,在膠的左上方;分子量>43 KD的蛋白居多。見圖2。

圖2 雙向凝膠電泳考馬斯亮藍染色圖譜

3 討論

生物分子學內容廣泛,主要涉及核酸和蛋白質兩大類,目前,核酸分子的研究相對較多,實際上核酸和蛋白質兩大生命分子對生命的意義同樣重要,蛋白質的未知領域更廣闊。二維凝膠電泳技術是蛋白研究的基本技術,依據等電點和分子量兩個維度對蛋白質分子進行分離,重復性良好,理論上可以分離所有的蛋白分子。二維凝膠電泳技術與質譜技術結合,在尿液中可篩查到前列腺癌的靶標蛋白[5],在大腸癌組織細胞中可檢測到癌的生物標記物[6]。但由于實驗過程復雜、費用昂貴、操作困難等原因,影響其應用。二維凝膠電泳在蛋白質組學分析上仍然是非常重要的技術,尤其是與新近發明的細胞熱轉移技術結合形成的熱蛋白組技術(2DE-TPP),對于藥物作用的蛋白靶點研究尤為重要[7]。此技術也將會在中藥現代化工程中發揮重要作用,中草藥成分復雜,不易被提取,導致許多中藥主要成分確切作用的蛋白質靶分子不為人知,也因此削弱了中草藥的應用價值,二維凝膠電泳技術的應用有可能在這方面有所突破。

二維凝膠電泳技術的建立和發展有數十年,有了很多改進,但聚丙烯酰胺凝膠分離系統,尤其是大膠板,需要臨時配制,而本文使用的大膠板可以分析長度7、11、13、18、24 cm的IPG膠條。 雖然有專門的器具保障制膠的質量,但其一次性制備膠板數量太大,或者專門的制膠器具出現損壞不能使用的情況下,本制膠法非常合適。本研究探討了分次灌膠制膠板的設想,原理是每次少量灌膠,讓其凝固,兩次后底部形成密封層,然后整個膠板灌注就不會出現漏膠現象。結果顯示,分次灌膠,大膠制作成功率90%;單次灌膠,大膠制作成功率只有20%。3次灌膠制作大膠法,操作簡單,配制過程中只要膠帶封住底口,垂直放置即可,不需要其他特殊的設施。采用此法制備的大膠進行電泳,結果顯示,蛋白點分布均勻、形態好,達到文獻報道的二維凝膠電泳圖形質量[8]。分次灌膠形成的密封層,化學組成與整個大膠一致,理論上不會對實驗結果產生影響。由于每次灌膠后需等待凝固,因此下一次灌膠液中多加點TEMED,劑量可根據氣溫和預期凝固的時間確定。