RBM10,Caspase-9和內皮一氧化氮合成酶(eNOS)在早中期胚胎蛻膜組織的表達①

閆風智,劉 瑤,蔣 立,任亞萍,楊 森,盧德杰

(桂林醫學院a.基礎醫學院;b.臨床醫學院;c.組織學胚胎學教研室,廣西 桂林 541199)

妊娠過程極其復雜,子宮蛻膜化作為整個妊娠周期的關鍵步驟,是胚胎植入成功的前提并決定著后期滋養細胞的侵襲程度,在一定程度上對后期胚泡著床、胎盤形成等一系列過程起到精確調控作用[1]。細胞為適應機體生長發育的需求而進行的自我淘汰過程稱為凋亡,這種程序性細胞死亡模式補充了經典的半胱天冬氨酸蛋白酶介導的凋亡模式[2],而且細胞凋亡在整個妊娠周期中都發揮了極其重要的作用。RBM10基因是位于X染色體上的RNA結合蛋白和凋亡相關基因的剪接調節劑[3]。RBM10的表達誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖[4],在細胞凋亡的進程中,caspase-9作為線粒體凋亡通路的起始因子,caspase-9的釋放可激活下游的凋亡因子,最終導致活化的半胱天冬蛋白酶發生層疊級聯反應引發細胞凋亡[5]。故本實驗研究探討RBM10、caspase-9和eNOS在孕鼠早中期蛻膜組織表達及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性未交配的昆明鼠35只(SPF級),鼠齡(49±2)d,體重25.0~30.0 g;雄性昆明鼠6只,鼠齡(56±2)d,體重40.0~50.0 g左右(均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,SPF級)。動物飼養于光照周期為12 h開燈,12 h關燈的明暗變化環境中,每天光照時間段為6∶00~18∶00,相對濕度35.0%~45.0%,室溫保持24℃左右,可自由采食、飲水(飲用水經過消毒處理)。本研究獲得桂林醫學院實驗動物委員會的批準。

1.2 實驗材料

RBM10、caspase-9以及內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的兔抗鼠多克隆抗體(均購自北京中杉金橋);瑞氏染液(安徽雷根生物);中性樹膠(珠海貝索生物);乙醇,石蠟,福爾馬林DAB(北京中杉金橋);包埋器、石蠟切機、染色操作臺、恒溫水浴鍋;顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 實驗方法

1.3.1 受孕與組織標本采集 將昆明小鼠放入桂林醫學院動物房飼養1周后,于第1天晚上用陰道脫落物做陰道脫落細胞檢查:用消毒棉簽粘取少量生理鹽水輕輕插入雌鼠陰道輕轉一圈,取出棉簽涂抹在載玻片上,滴加2~3滴甲醇固定,待載玻片風干后,滴加2滴瑞氏染液染色3 min,再滴加PBS緩沖液(pH=7.0)混勻,10 min后,輕甩去掉玻片上染液,自來水沖洗30 s,自然風干后封片,顯微鏡下觀察。以觀察到陰道脫落細胞中出現大量角化上皮細胞,并且極少見炎癥細胞者為合籠最佳時機小鼠。

雌鼠進入發情周期時將雌雄鼠按4∶1合籠,第2天清晨進行察看,看到白色陰道栓即確定為孕鼠,記為妊娠第1天,隨機抽取6.5~9.5 d孕鼠進行取材。采用頸椎脫臼法將孕鼠處死,于腹部正中線恥骨聯合上方0.5 cm處切開暴露子宮及輸卵管,用手術器械將子宮頸及輸卵管剪斷并且將其完整取出,同時將斷端結扎,標本放置入包埋液中固定保存,標注日期、序號。

1.3.2 免疫組織化學檢測 36%的中性甲醛固定子宮組織24 h,石蠟包埋組織后連續切片(5μm),60℃恒溫箱烤片1 h左右脫蠟,乙醇水化后蒸餾水沖洗1次,時間1 min,用乙二胺四乙酸抗原修復組織切片,蒸餾水沖洗,阻斷內源性過氧化物酶10 min,PBS洗3次,5 min/次,BSA封閉30 min,然后加入稀釋好的一抗(RBM10稀釋度1∶200,eNOS稀釋度1∶100,caspase-9稀釋度1∶50)50μl,37℃孵育1 h,用PBS(pH=7.4)沖洗3次,5 min/次,加入二抗37℃孵育30 min后,用PBS緩沖液沖洗3次,5 min/次,加DAB液(100μl)顯微鏡下觀察,顯色后用蒸餾水沖洗切片,蘇木素復染30 s,自來水沖洗10 min,酒精梯度脫水,分別為75%酒精5 min,85%酒精5 min,95%酒精5 min,100%酒精8 min,然后二甲苯透明2×10 min后,放于通風廚中風干,樹膠封片,顯微鏡下觀察并采集圖片,之后用IPP 6.0版本圖像軟件標記,測定各組光密度值即為各組蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 RBM10、caspase-9與eNOS在組織中的表達定位

Caspase-9集中表達于蛻膜組織的腺上皮細胞胞質及部分基質細胞的胞質;RBM10表達于蛻膜細胞的細胞核,合體滋養層細胞胞核,腺細胞胞核,基質細胞胞核;eNOS在基蛻膜細胞胞質呈弱陽性表達。表達陽性為染色呈棕褐色、棕黃色。見圖1。

圖1 免疫組織化學檢測RBM10,Caspase-9和eNOS的表達(20×)

2.2 RBM10,caspase-9與eNOS表達量

Caspase-9在孕鼠8.5 d的蛻膜組織中表達高于6.5 d、9.5 d(P<0.05);RBM10在孕鼠8.5 d的子宮蛻膜中表達高于6.5 d,且在8.5 d時達高峰后下降,9.5 d時的表達低于8.5 d(P<0.05);eNOS在孕鼠蛻膜化的6.5 d、8.5 d和9.5 d時,呈弱陽性表達,且8.5 d時的表達水平高于9.5 d(P<0.05)。見圖2。

圖2 RBM10、caspase-9、eNOS表達的灰度分析(?P<0.05,??P<0.01)

3 討論

蛻膜化被認為是建立可接受的子宮內膜微環境以支持和維持妊娠的關鍵過程[6]。目前調控細胞凋亡的研究主要集中于線粒體與死亡受體兩種途徑[7],caspase-9是細胞凋亡線粒體通路的關鍵起始因子[8]。在本研究中,Caspase-9在妊娠早中期發育過程中,隨胚胎發育表達逐漸升高,在8.5 d時,表達最高,但到第9.5天又很快下降,提示妊娠8.5 d時,子宮蛻膜細胞以凋亡為主。caspase-9在早中期蛻膜組織細胞中的表達變化,提示caspase-9在蛻膜形成的早期已經啟動凋亡程序并為蛻膜增厚及胚胎的順利定位做準備,但在第8.5天處于凋亡表達最高,根據增殖與凋亡的動態平衡,胚胎第8.5天也是子宮蛻膜增殖生長發育最活躍的時間點。因此,推測在蛻膜化中主要是通過caspase9的凋亡通路而引起細胞發生凋亡。RBM10在子宮蛻膜中的表達量先升高,在胚胎的8.5 d達到高峰后下降,提示RBM10在蛻膜化的早中期通過細胞的增殖與凋亡來推進妊娠過程的發展。胚胎干細胞和小鼠腭細胞因缺乏RBM10,細胞生長緩慢[9],同樣說明RBM10的表達與細胞增殖有關。圖2結果顯示,caspase-9和RBM10呈同步變化,推測caspase-9與RBM10的表達可能具有相關性,caspase-9與RBM10共同參與早中期蛻膜化的發生,兩者可能共同協調,完成蛻膜的增殖和凋亡活動,維持蛻膜化過程中蛻膜細胞及滋養細胞之間的動態平衡,使蛻膜的基質細胞、血管和腺細胞的生長發育至一定的水平,為胚胎植入及其生長發育提供了充分的準備。

蛻膜化進程中通常伴隨血管改變,而這對后續胚泡著床及胎盤形成至關重要。RBM10表達與VEGF的表達增加相關,RBM10自身磷酸化也支持RBM10在調節血管生成中的作用,RBM10表達異常導致胚胎早期死亡[10]。這可能意味著RBM10參與了早中期胚胎發育過程中血管的建立。Caspase-9在基質細胞中明顯高表達,隨著妊娠進展基質細胞承擔啟動新血管形成任務。本課題組前期研究顯示eNOS在滋養層細胞之間的血管、胚外中胚層細胞之間毛細血管內皮均有較強表達,而胚外中胚層細胞將發育為絨毛膜的組織,說明在胚胎著床后,NO發揮著重要作用。圖1顯示,eNOS表達于基蛻膜細胞胞質,隨著蛻膜化進展,基蛻膜將參與胎盤形成。提示eNOS在胎盤新生血管及維持血管擴張以提供豐富血液,對促進胚胎生長發育方面具有重要意義。妊娠期間的子宮肌層內的NOS釋放NO,與其他的因子共同維持孕期子宮肌層的舒張與血管構建。RBM10與caspase-9在蛻膜化過程中表達規律,提示二者可能共同參與了胚泡的著床及血管構建進程。而eNOS在妊娠早期表達量低,少量NO可能參與著床處血管壁的構建。

蛻膜化在整個妊娠階段起到奠基作用并在其辨別胚胎質量方面發揮重要作用。敲除小鼠ES細胞中的RBM10導致細胞生長急劇下降,并影響胚狀體的形成[11],提示RBM10在妊娠早期發揮重要作用。eNOS通過調節NO的含量來調控血管,NO作為細胞的信號分子,在維持子宮蛻膜化、新血管形成方面發揮作用[12]。eNOS在胚胎蛻膜組織中的表達變化,推測早期胎盤還未完全形成,血液交換較少,胚胎處于相對缺氧的環境中,隨后母胎之間營養物質快速交換,循環逐步形成,此時eNOS表達水平的增加為NO合成奠定了基礎。根據胚胎發育周期規律提示,caspase-9可能參與了胚胎植入與神經溝的建立過程;凋亡因子caspase-9與RBM10在胚胎蛻膜組織的表達變化規律,提示小鼠妊娠的第8.5天是非常有意義的1天,此時胚胎植入完成,蛻膜生長包裹整個胚胎,為胚胎的生長發育提供了適宜的環境及充足的營養供應。同時期小鼠的器官原基已建立,增殖的細胞可通過細胞凋亡途徑來達到維持細胞的穩態環境和機體生長發育的需要。Caspase-9和RBM10在蛻膜的高表達提示凋亡因子可能參與了胚胎三胚層及神經溝的構建過程。人類妊娠過程中胚胎植入時間比孕鼠晚,人類需要更長植入過程及器官原基發育時間,而這將決定整個妊娠的質量及出生后疾病發生概率。

本研究結果說明RBM10,caspase-9和eNOS在早中期蛻膜化過程中共同調節妊娠子宮蛻膜細胞的增殖與凋亡及胚胎生長發育過程。子宮蛻膜化對于整個妊娠周期的發展起到極為關鍵作用,而內膜受損則會導致反復流產、不孕不育、子宮內膜疾病及子宮內膜異位癥結節的發生等。凋亡因子RBM10,caspase-9在子宮蛻膜組織的表達變化類似,推測其可能具有相關性。