99mTc-HYNIC-PTP的制備及其胰腺癌裸小鼠移植瘤模型SPECT顯像研究

龔佳麗，趙凌舟，趙晉華

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院核醫(yī)學科，上海 200080

胰腺癌是一種具有高度侵襲性和可快速致命的腫瘤，其患者5年生存率不到10%［1-2］。生存率低的一個重要原因是大多數(shù)（超過85%）患者早期癥狀不明顯，確診時已處于疾病晚期，失去了相應的手術(shù)機會。因此，胰腺癌的早期診斷能為患者帶來更好的預后。目前，臨床上沒有可靠的血清標志物用于胰腺癌的早期診斷，而傳統(tǒng)的影像學技術(shù)如計算機體層成像（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和超聲在胰腺癌診斷和分期上仍不令人滿意［3］。分子影像技術(shù)近年來蓬勃發(fā)展，能夠在細胞和分子水平評估疾病發(fā)生、發(fā)展過程，實現(xiàn)疾病的早期精準診斷。研究表明，多種生物靶點有潛力用于胰腺癌診斷，包括間皮素［4］、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）［5］、黏蛋白1（mucin 1）［6］、胰島素樣生長因子-1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）［7］、網(wǎng)蛋白（plectin）等。在這些靶點中，plectin在正常胰腺組織內(nèi)低度表達，而在胰腺癌上皮細胞膜表面和細胞質(zhì)內(nèi)高表達，并且表達程度與胰腺癌的惡性程度呈正相關(guān)，是胰腺癌診斷和治療的一個極具吸引力的靶點［8-9］。網(wǎng)蛋白靶向肽（plectin targeted peptide，PTP）是從噬菌體展示肽庫中篩選出來的七肽，能與plectin靶向結(jié)合。因此，本研究選取PTP多肽為胰腺癌靶向分子，經(jīng)過螯合劑肼基煙酰胺（hydrazino-nicotinamide，HYNIC）修飾后，進行放射性核素99mTc標記，獲得靶向分子影像探針99mTc-HYNIC-PTP，在裸小鼠BxPC-3移植瘤模型中評估該探針用于胰腺癌單光子發(fā)射計算機斷層成像（single photon emission computed tomography，SPECT）的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

H Y N I C-P T P多肽和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-PTP購自上海強耀生物科技有限公司，Na99mTcO4購自上海原子科興藥業(yè)有限公司，BxPC-3、PANC-1和β-TC-6細胞購自上海宏順生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰酶和磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）及其他試劑購自上海迪奧生物科技有限公司，4～6周齡BALB/c雌性裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，薄層色譜儀購自美國Bioscan公司，SPECT儀購自美國GE公司（配以低能通用準直器）。

1.2 方法

1.2.199mTc-HYNIC-PTP的制備與體外穩(wěn)定性評價

取50 μg HYNIC-PTP，加入0.5 mL乙二胺二乙酸溶液（20 mg/mL，含0.1 mol/L NaOH溶液）與0.5 mL 三（羥甲基）溶液（40 mg/mL，含0.2 mol/L PBS，pH=6.0）的混合液中，再加入2 5 μ L S n C l2溶液（1 mg/mL，含0.1 mol/L HCl）和50 mCi（1 mCi=3.7×107Bq）Na99mTcO4溶液，沸水浴中反應10 min。反應結(jié)束，自然冷卻至室溫，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，快速薄層色譜（instant thin layer chromatography，ITLC）法測定標志物放射化學純度。然后分別取100 μL標志物與900 μL PBS溶液（pH=7.4）室溫下混合或900 μL FBS于37 °C混合，測定1、2、4和6 h放射化學純度，評價體外穩(wěn)定性。ITLC方法為溶液點樣硅膠板，以50%乙腈為流動相展開。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

配制含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基與DMEM培養(yǎng)基。從液氮罐中取出凍存的BxPC-3、PANC-1和β-TC-6細胞，于37 °C水浴箱快速復溫解凍，在超凈工作臺上將解凍的細胞懸液吸入離心管中，棄上清液，BxPC-3和PANC-1細胞加入RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并移入培養(yǎng)皿中，β-TC-6細胞加入DMEM培養(yǎng)基。3種細胞于37 °C、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；隔天換液，待細胞生長融合度達80%～90%，用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化并傳代。

1.2.3 BxPC-3皮下胰腺癌裸鼠模型建立

4～6周齡雌性BALB/c裸小鼠前肢皮下注射1×107個胰腺癌細胞（100 μL PBS溶液），在標準動物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，待腫瘤直徑達到0.8～1.0 cm時用于動物實驗。

1.2.4 細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）細胞毒性試驗

CCK-8細胞毒性試驗評價HYNIC-PTP多肽體外對BxPC-3細胞的潛在毒性：取對數(shù)生長期的BxPC-3細胞接種于96孔板內(nèi)，設置6個副孔，每孔加入8×103個細胞，于培養(yǎng)箱溫育。24 h后，對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度（0～200 μg/mL）的HYNIC-PTP多肽，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱溫育24 h。隨后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL新鮮無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，溫育2 h后，96孔板置于酶聯(lián)免疫儀內(nèi)，檢測每孔內(nèi)吸光度（D）值（450 nm），計算細胞存活率。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

采用Western blot比較PANC-1細胞、BxPC-3細胞和β-TC-6細胞plectin蛋白表達水平。取對數(shù)生長期的3種細胞，分別提取總蛋白，步驟如下：6%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，TBST洗3次，每次5 min。加入一抗（1∶1 000）4 °C過夜，TBST洗3次，每次10 min，二抗溫育2 h，TBST洗3次，每次1 0 m i n，電化學發(fā)光（e l e c t r ochemiluminescence，ECL）法曝光，X線膠片曝光，顯影，定影錄條帶，掃描膠片。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測

采用流式細胞術(shù)檢測FITC-PTP體外靶向結(jié)合BxPC-3細胞的能力：取對數(shù)期BxPC-3和PANC-1細胞，分別接種于6孔板內(nèi)，2×105個/孔，貼壁24 h后換為無血清培養(yǎng)基，實驗組加入12.5 μL FITC-PTP的PBS溶液（10 μmol/L），空白對照組加入同等體積的PBS，置于培養(yǎng)箱溫育4 h。隨后棄去培養(yǎng)基，消化離心細胞（1 000 r/min，3 min），再用PBS離心清洗2次（1 000 r/min，3 min），最后重懸細胞于200 μL的FACS緩沖液（PBS∶FBS=50∶1）中，上機檢測。

1.2.7 SPECT顯像

將皮下移植瘤裸小鼠麻醉后，尾靜脈注射99mTc-HYNIC-PTP（200 μL，2 mCi）后，分別于注射后0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 h進行SPECT顯像。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用獨立樣本t檢驗（Student’s t檢驗）進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 99mTc-HYNIC-PTP放射化學純度及穩(wěn)定性評價

從99mTc-HYNIC-PTP標志物的ITLC圖譜（圖1A）中可見，未標記的游離99mTc移到前沿，99mTc膠體在原點，99mTc-HYNIC-PTP在中間，說明50%乙腈展開體系能夠有效地鑒別標志物和雜質(zhì)。經(jīng)計算后，99mTc-HYNIC-PTP放射化學純度在99%以上（99.6%），無須進一步純化；體外穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，99mTc-HYNIC-PTP在PBS和FBS中穩(wěn)定性高（圖1B），6 h內(nèi)放射化學純度無明顯變化，表明標志物體外穩(wěn)定性良好。

圖1 99mTc膠體、99mTc-HYNIC-PTP和游離99mTc在50%乙腈展開體系中的ITLC圖譜（A）及99mTc-HYNIC-PTP在PBS和FBS中不同時間點的放射化學純度（B）

2.2 CCK-8細胞毒性試驗

CCK-8試驗結(jié)果（圖2）顯示，在HYNICPTP多肽濃度為0～200 μg/mL，BxPC-3細胞存活率均在90%以上，表明在給定的濃度范圍內(nèi)，HYNIC-PTP多肽具有良好的細胞相容性。

圖2 CCK-8檢測不同質(zhì)量濃度HYNIC-PTP多肽對BxPC-3細胞存活率影響

2.3 Western blot檢測

從Western blot圖可知，BxPC-3細胞與PANC-1細胞中反映plectin表達的條帶灰度都明顯高于陰性對照細胞β-TC-6（圖3），表明胰腺癌BxPC-3細胞內(nèi)plectin的表達量遠高于β-TC-6細胞（P＜0.001）。

圖3 Western blot比較PANC-1細胞、BxPC-3細胞與β-TC-6細胞內(nèi)plectin的蛋白表達量（A）及定量灰度值分析（B）

2.4 流式細胞術(shù)檢測

研究［14］表明，PTP能與PANC-1細胞膜上的plectin靶向結(jié)合，因此，本研究在流式細胞術(shù)中以PANC-1作為陽性對照。結(jié)果（圖4）顯示，BxPC-3細胞與PANC-1細胞的相對熒光強度接近，相差很小，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明PTP多肽能夠結(jié)合BxPC-3細胞，具有良好的靶向性。

圖4 流式細胞術(shù)檢測FITC-PTP與PANC-1細胞和BxPC-3細胞靶向能力比較

2.5 皮下胰腺癌移植瘤裸小鼠SPECT顯像

SPECT圖像顯示，99mTc-HYNIC-PTP在腎臟和膀胱有持續(xù)的濃聚，提示顯像劑主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，而肝臟、脾臟、心臟及軟組織等顯影微弱，甲狀腺區(qū)域未見放射性攝取。尾靜脈注射0.5 h后，腫瘤部位即有顯影，隨后腫瘤攝取持續(xù)增加，周圍組織放射性迅速減弱；2.0 h時腫瘤顯像清晰，同時靶/非靶值（tumor/non-tumor，T/NT）最高（大約為3.9%ID/g），之后緩慢減弱，6.0 h仍有明顯顯影，表明99mTc-HYNIC-PTP在體內(nèi)能夠選擇性聚集在腫瘤組織，并且有相對較長時間的滯留（圖5）。

圖5 皮下胰腺癌裸鼠尾靜脈注射99mTc-HYNIC-PTP后不同時間點的SPECT顯像（A）及不同時間點SPECT顯像的T/NT值（B）

3 討 論

正常的胰腺從癌前病變發(fā)展成浸潤性癌要經(jīng)歷復雜的致癌過程。在約80%的胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，胰腺的癌前病變?yōu)樯掀?nèi)瘤變（pancreas intraepithelial neoplasia，PanIN），分為PanIN1A、PanIN1B、PanIN2和PanIN3。PanIN1和PanIN2幾乎不會進展成胰腺癌，而PanIN3是胰腺癌變的一個重要前體［10］。因此，如果一種生物標志物能在PanIN3特異性表達，就能成為胰腺癌早期診斷與治療的有效靶點。

Plectin是一種細胞骨架蛋白，相對分子質(zhì)量為500 000，在哺乳動物的正常組織和細胞中有不同程度的表達［11-12］。Kelly等［8］通過蛋白質(zhì)體外結(jié)合實驗、Western blot和質(zhì)譜分析，確定了plectin高表達于鼠源性和人源性胰腺癌細胞膜上和細胞質(zhì)內(nèi)，但在正常鼠源性胰腺導管細胞、人源性胰腺導管上皮細胞質(zhì)內(nèi)和細胞核內(nèi)表達量不高。在后續(xù)的研究［9］中又發(fā)現(xiàn)plectin在上皮內(nèi)瘤變Ⅰ～Ⅱ級時，表達量為0.00%～3.85%，但在上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級時，表達量增加到60%，而且在移植瘤小鼠模型的淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移部位也發(fā)現(xiàn)plectin表達［13］。因此，plectin有潛力成為胰腺癌早期診斷、分期和預后監(jiān)測的生物標志物。

PTP是從噬菌體展示肽庫內(nèi)篩選出來的7肽，能與plectin特異性結(jié)合。許多研究［14-15］證實，PTP多肽可作為靶向分子直接與顯像基團連接或修飾在納米材料表面構(gòu)建靶向胰腺癌的分子探針，用于胰腺癌的顯像。Wang等［14］設計了一種雙靶向雙模態(tài)分子探針（Gd-Cy7-PTP/RGD），修飾的PTP和RGD多肽分別靶向plectin和整聯(lián)蛋白，釓（Gd）和熒光染料（Cy7）進行磁共振和熒光成像。Pal等［15］在PTP多肽的C端引入半胱氨酸和酪氨酸殘基，以其為模板合成金納米顆粒（GNPs），同時連接吉西他濱，制備了一種基于GNPs的靶向藥物遞送系統(tǒng)，在PANC-1原位移植瘤模型中具有優(yōu)異的抗腫瘤功效。在核醫(yī)學顯像方面，目前僅有Bausch等［9］報道的111In標記四聚體PTP（tPTP）用于胰腺癌的SPECT/CT顯像，然而111In核素目前國內(nèi)供應困難，且半衰期較長，體內(nèi)輻射量較大，不利于臨床轉(zhuǎn)化。因此，本研究利用放射性核素99mTc標記plectin靶向多肽PTP，制備了分子探針99mTc-HYNICPTP，用于胰腺癌的SPECT顯像。相比于111In標記tPTP，99mTc-HYNIC-PTP具有易制備、合成簡易和半衰期短等優(yōu)勢。

本研究利用雙功能螯合劑HYNIC進行PTP標記99mTc，標記方法簡單，放射化學純度高（在99%以上），無須進一步純化。在體外實驗中，Western blot結(jié)果表明plectin在陰性對照細胞中低表達，在BxPC-3和PANC-1胰腺癌細胞中都高表達；在流式細胞術(shù)中，本研究選擇已證實plectin高表達的PANC-1細胞作為陽性對照，結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-PTP在兩種細胞中的熒光強度無明顯差異，能有效地與BxPC-3細胞靶向結(jié)合。在體內(nèi)顯像研究中，皮下胰腺癌移植瘤裸小鼠SPECT結(jié)果顯示，99mTc-HYNIC-PTP在腎臟和膀胱攝取最高，主要經(jīng)腎臟排泄，其他器官如肝、脾、胃腸等攝取少；腫瘤攝取在注射顯像劑0.5 h后即有明顯顯影，1.0～2.0 h后顯像最為清晰，之后緩慢減弱，但6.0 h后仍顯像清晰，表明99mTc-HYNICPTP具有良好的體內(nèi)靶向性和滯留時間。上述研究結(jié)果表明，本研究制備的99mTc-HYNIC-PTP有潛力成為一種易于合成的胰腺癌靶向分子影像探針。