美洲錦鳚抗凍蛋白的表達與特性分析

陳 瑩, 趙慶春, 吳 瓊, 胡 北, 許子華

(中國人民解放軍北部戰區總醫院 藥學部實驗室， 遼寧 沈陽 110000)

0 引言

【研究意義】我國高寒地域廣泛，涵蓋東北、西北、華北等，人體長時間暴露在低溫環境中極易導致寒冷損傷，急需增強抵御寒冷的能力和提高寒冷情況下的作業能力[1]?？箖龅鞍资且活惸芤种票L或抑制重結晶的蛋白質，主要應用于農業、醫學、食品、工業等領域，醫學方面的應用主要集中在細胞及器官的超低溫保存方面，若能拓展至凍傷防治領域，將會是一大突破，對寒冷損傷的預防研究具有重大意義[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】生活在低溫環境下的魚類為了適應生存環境，在長期進化中產生了一種能抑制冰晶生長或抑制重結晶的蛋白質，即抗凍蛋白(antifreeze peoteins,AFPs)?？箖龅鞍鬃钤缭?969年由Devries在極區海魚血液中發現，目前已證明AFPs普遍存在于魚類、植物、昆蟲、細菌和真菌中[1-3]?？箖龅鞍啄茉诮Y冰或亞結冰條件下保護生物體不受傷害，海水的冰點大約在-1.8℃，由于導熱介質的不同，海水中的溫度變化比陸地小。針對抗凍蛋白的作用機制研究，學者們提出了多種假說，大多數研究者比較接受Raymond在1977年提出的吸附抑制學說，該學說認為在低溫條件下，AFPs具有選擇吸附性，首先結合在冰晶生長的表面，使冰晶停止生長，而未被AFPs覆蓋的區域晶體則沿著平面逐漸向前推進，最終形成圓形的表面，使其表面曲率增加，進而增加晶體表面積，從而影響晶體生長[4-8]?！狙芯壳腥朦c】基于仿生學原理，利用分子生物學技術，結合生物信息學分析，研究美洲錦鳚抗凍蛋的表達與特性，為探索寒冷損傷防治的新方法奠定理論基礎?！緮M解決的關鍵問題】美洲錦鳚體內的抗凍蛋白為Ⅲ型抗凍蛋白，研究低溫誘導獲得可溶性AFPs的誘導條件，通過生物信息學分析構建美洲錦鳚抗凍蛋的低溫表達系統，研究魚類抗凍蛋白的特征特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 PMD18T-AFP質粒、感受態大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、BL21(DE3)均為中國人民解放軍北部戰區總醫院藥學部實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 PCR擴增試劑、限制性內切酶Xho I、Nde I，T4 DNA連接酶，Taq酶以及DL2000 DNA marker等購自寶生物工程(大連)公司，異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp+)、超低分子量蛋白marker、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、考馬斯亮藍快速染色液均購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 構建表達載體 設計引物：F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，R: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。通過PCR從PMD18T-His6-AFP質粒上獲取目的基因，利用Xho Ⅰ、VNdeⅠ限制性內切酶雙酶切，得到的酶切片段用T4 DNA連接酶與pET22b載體連接，使目的基因克隆至pET-22b載體。將重組質粒轉化E.coli BL21(DE3)的感受態細胞，并涂布于含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體培養基上，37℃倒置培養。通過菌落PCR鑒定，擴增所得的片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出陽性克隆的單菌落，并送至金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.2.2 誘導表達 將重組菌株接種至含Amp+的新鮮LB液體培養基中，恒溫震蕩培養至OD600為0.6～0.8，考察不同誘導溫度(18℃，28℃，37℃)及不同終濃度誘導劑(IPTG)(0 mmol/L, 0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.4 mmol/L)對目的蛋白表達量的影響，優化誘導條件。培養結束后，離心去除培養基，收集菌體，超聲破碎后離心，吸取上清液，得到可溶性蛋白，通過 Elisa分析蛋白表達情況，確定最佳誘導條件。

1.2.3 蛋白純化 經擴大培養后收集菌體，超聲破碎的上清液通過Chelating Sepharose Fast Flow層析對含有His-tag的目的蛋白進行純化，將樣品以0.8 mL/min的流速上樣，再用含不同濃度咪唑的緩沖液洗脫，收集不同條件下的洗脫液進行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 質譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定 從Tricine-SDS-PAGE分析的膠條上切取目的蛋白，經處理后通過MALDI-TOF/TOF串聯質譜儀檢測，采用自動獲取數據及正離子模式進行數據采集，將一級與二級質譜數據整合，并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.3(Matrix Science)對數據進行全面分析和蛋白鑒定。

1.2.5 生物信息學分析 從基因數據庫(GenBank/EMBL)中獲取各種魚類抗凍蛋白的序列信息，用MEGA 7.0 進行多序列比對，用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統進化樹。

1.2.6 性質分析 根據結構、活性、作用機制等的差異，對幾種魚類抗凍蛋白的性質進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 載體構建

培養后的菌落通過PCR鑒定(圖1)，篩選出的陽性單菌落序列與GeneBank中魚類抗凍蛋白的序列比對一致。

注：M為DNA marker，1～5為AFP的PCR產物。

2.2 誘導表達

從圖2看出，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，誘導溫度為18℃時，目的蛋白表達量最高。

圖2 不同誘導溫度及誘導劑不同濃度處理目的蛋白的表達量

2.3 蛋白分離純化

電泳結果(圖3)顯示，最終純化的蛋白僅有1條清晰條帶，說明目的蛋白基本達到電泳純。

注：M為Protein ladder，1為菌體裂解液，2為穿過液，3為洗滌液，4為低濃度咪唑洗脫液，5為高濃度咪唑洗脫液。

2.4 質譜(MALDI-TOF-TOF)鑒定

通過 MALDI-TOF/TOF串聯質譜儀對目的蛋白進行鑒定，有效地優化了誘導條件，通過GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot2.3(Matrix Science)對數據進行全面分析和蛋白鑒定結果顯示(圖4)，目的蛋白為美洲錦鳚抗凍蛋白。

圖4 重組AFP的質譜鑒定結果

2.5 生物信息學

從圖5可知，美洲錦鳚AFP與大西洋狼魚(Anarhichaslupus)、大西洋鯡(Clupeaharengus)、鱖魚(Sinipercachuatsi)等魚類的親緣關系較近，與其他魚類的親緣關系較遠。

圖5 魚類AFP氨基酸序列的系統進化樹

2.6 魚類幾種抗凍蛋白的性質

從表1和圖6看出，在魚類幾種抗凍蛋白中分子量最小的是AFPⅠ，其富含丙氨酸，結構相對簡單，由α螺旋組成，主要與冰晶表面的錐面或二級棱面結合。AFP II分為2種亞型，Ca2+依賴亞型與Ca2+不依賴亞型，其中Ca2+有助于蛋白質分子構象的穩定，分子中所含的半胱氨酸形成幾對二硫鍵，整個結構中包括多個α螺旋、β折疊及無規則卷曲，其主要通過錐面或二級棱面與冰晶表面結合。作為球狀蛋白的AFP III，主要由多個β折疊組成，與冰晶的錐面和棱面發生相互作用。AFGP富含糖基，由三糖肽(-Ala-Ala-Thr-)串聯而成，可分為8種亞型，AFGP1亞型分子量最大，而AFPG8亞型分子量最小，主要與冰晶的棱面相結合。HAFP是最后一類發現的魚類抗凍蛋白，由相同亞基組成同源二聚體，空間結構呈四螺旋捆，通過錨定機制與冰晶結合[8-11]。

表1 魚類幾種抗凍蛋白的性質

圖6 魚類幾種抗凍蛋白的構象

3 討論

目前，抗凍蛋白的基因工程表達大多是利用原核表達體系。對IPTG誘導條件優化結果表明，不同誘導溫度和終濃度誘導劑(IPTG)對表達效率有影響，重組美洲錦鳚抗凍蛋白在18℃及0.1 mmol/L IPTG的誘導條件下表達水平更高。表明，較低的溫度降低了蛋白質折疊速率，低濃度的IPTG降低了表達速率，盡可能避免了包涵體的生成，產生的可溶性蛋白更利于分離純化[12-14]。此外，作為小分子蛋白質的AFP宜采用Tricine-SDS-PAGE進行分析，以彌補普通SDS-PAGE對較低分子量的蛋白質分辨率不高的缺點。當較大的冰晶以小冰晶為單位逐漸生長時，就會形成重結晶，造成組織的物理損傷，這種現象是造成細胞損傷的主要原因。通過與冰晶結合，抑制其生長和變形，并控制及阻斷重結晶過程，有效減少細胞和組織的損傷[15-19]。

抗凍蛋白是一種高效的生物活性物質，因具有特殊的熱滯活性已被廣泛地應用在相關的農業、工業、醫學、食品等領域，其在冷凍食品工業中發揮著很好的保鮮作用，BINDSLEV-JENSEN等[20]曾經對抗凍蛋白的致敏性進行研究，發現其與已知的過敏源沒有同源性，且在加入抗凍蛋白之后無組胺釋放，表明抗凍蛋白無致敏性，是一種比較安全的食品添加劑，應用價值潛力巨大。

4 結論

研究成功構建了美洲錦鳚抗凍蛋白的低溫表達系統，通過生物信息學分析，采用鄰接法(Neighbor-joining)構建了系統進化樹。美洲錦鳚抗凍蛋白誘導的最佳溫度為18℃，IPTG加入終濃度為0.1mmol/L。美洲錦鳚AFP與大西洋狼魚(Anarhichaslupus)、大西洋鯡(Clupeaharengus)、鱖魚(Sinipercachuatsi)等魚類的親緣關系較近，而與其他魚類的親緣關系較遠。