HPLC法測定磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑中磺胺嘧啶的含量

熊 英，雷 健，邢 茂

磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑是醫院的自制制劑，用于治療鼻黏膜糜爛性潰瘍，鼻中隔手術后促進肉芽生長，加速傷口愈合，并有潤滑鼻黏膜的作用，可迅速緩解鼻炎術后患者鼻出血、鼻部干燥不適、嗅覺障礙、鼻癢、異物感等臨床癥狀，為醫院臨床不可或缺的非標準自制制劑[1]。其主藥磺胺嘧啶抗菌譜廣，對大多數革蘭陽性菌和陰性菌均有抑制作用[2-3]，輔料魚肝油又具有補充病變部位營養物質的作用，促進肉芽生長，具有標本兼治的功效[4]。原質量標準采用化學滴定法測定磺胺嘧啶的含量，已不能滿足新版藥典對藥品的質量要求。為了更好地控制藥品質量，保證臨床用藥安全，通過查閱文獻資料[5-7]，采用高效液相色譜(HPLC)法測定醫院自制制劑磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑中磺胺嘧啶含量，提高醫院自制制劑質量標準。

1 材料與方法

1.1 儀器 數字酸度儀（廠家：賽多利斯，型號：PB-10），高效液相色譜儀(廠家：安捷倫科技，型號：Agilent 1260)，反滲透制水機（廠家：重慶恒諾；型號：HN-2R0-2000）,電子天平（廠家：重慶福運來科技；型號：JA5003B）。

1.2 試藥 磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑由陸軍軍醫大學第二附屬醫院制劑室提供（批號：150212、150413、150511），對照品磺胺嘧啶購于中檢院（C10H10N4O2S；批號：100026-201404；含量以99.9%計）；原料藥磺胺嘧啶生產廠家為西南合成制藥（批號：201206131；含量以99.8%計）；色譜級乙腈、醋酸銨以及三乙胺生產廠家分別為Honeywell、Aladdin、天津市光復精細化工研究所；純化水；分析純乙酸乙酯和鹽酸購于重慶川東化工集團有限公司。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液 取SD對照品適量，置50 ml容量瓶中，加2 ml稀HCl，加流動相制成貯備液Ⅰ。精密量取貯備液Ⅰ2 ml，加流動相使成0.1 mg/ml溶液。

1.3.2 供試品溶液 量取20 ml稀HCl置分液漏斗，精密量取磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑2 ml加入上述分液漏斗中，用稀HCl分次洗滌移液管內壁，洗液并入分液漏斗中，量取10 ml乙酸乙酯，加入上述分液漏斗，充分振搖，分取稀HCl液。乙酸乙酯層再用20 ml稀HCl萃取，萃取兩次。合并稀HCl萃取液，置200 ml量瓶中，用流動相定容至刻度。精密量取1 ml上述溶液，置10 ml量瓶中，用流動相定容至刻度。

1.3.3 陰性對照溶液 照處方制備缺SD的磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑陰性樣品，再按1.3.2項下處理方法制備，即得。

1.4 色譜條件 色譜柱：島津Inertsil ODS-3-C18（250 mm×4.6 mm）；工作站：ChemStation for LC＆LC/MS systems Rev.C.01.05；流動相：0.3%醋酸銨溶液-乙腈(80∶20)；柱溫：25℃；進樣體積：10μl；檢測波長：260 nm。

1.5 專屬性實驗 取1.3.1、1.3.2及1.3.3項下3種溶液，按照1.4項下HPLC條件進行測定，記錄液相圖譜。

1.6 線性相關性考察 精密量取10 ml貯備液I，置25 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即為貯備液Ⅱ。分別取1.5 ml、3 ml、5 ml、8 ml貯備液Ⅱ，用流動相稀釋成質量濃度為0.029832、0.059664、0.09944、0.159104 mg/ml的溶液。分別取上述溶液及貯備液Ⅱ，按照1.4項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。

1.7 儀器精密度實驗 取對照品溶液，按照1.4項下色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖。

1.8 重復性實驗 取批號為150212的磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑2 ml，平行制備6份供試品溶液，按1.4項下色譜條件，測定150212批次磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑樣品含量。

1.9 中間精密度實驗 取批號為150212的磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑2 ml，平行制備6份供試品溶液，按1.4項下色譜條件，由不同于重復性實驗的人員按照1.4項下方法測定6份平行供試品溶液的含量。

1.10 加樣回收率試驗 精密稱定SD原料藥約8 g、10 g和12 g(分別約為處方量的80倍、100倍和120倍)，分別置于3個燒杯中，加入適量魚肝油，攪拌分散均勻，另取硬酯山梨坦0.5 g加水10 ml，加熱融化，再加入上述液體中，攪拌乳化后，加魚肝油至全量100 ml（約為處方的100倍），攪勻，即得。分別取上述燒杯中不同濃度磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑樣品適量，各3份，置125 ml分液漏斗中，按照1.3.2項下方法平行制備9份。按照樣品測定方法操作，記錄色譜圖，計算SD回收率。

1.11 溶液穩定性實驗 取同一批磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑，按照1.3.2項下方法制備供試品溶液。分別于0、2、4、6、8 h按1.4項下色譜條件測定，考察制劑中SD峰面積變化。

1.12 耐用性實驗 按照1.3.1和1.3.2項下方法，制備對照品溶液及樣品溶液，將色譜條件參數作適當變化后，在不同的色譜條件下測定樣品含量，考察方法的耐用性。

1.13 含量測定 取磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑3批（批號：150212、150413、150511），按1.3.2項下方法制備供試品溶液，按1.4項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算該自制制劑中SD含量。

2 結果

2.1 專屬性實驗 結果顯示在S D出峰處無其他輔料峰干擾，說明空白輔料對SD的含量測定無干擾作用，該方法專屬性良好（圖1）。

圖1 高效液相色譜

2.2 線性相關性考察 以峰面積值A為縱坐標（y），以SD對照品濃度C為橫坐標（x），進行回歸分析，計算得線性方程：y=44030x-75.37，相關系數為1。結果表明，SD在29.83～198.9μg/ml范圍內，濃度C與其峰面積A呈較好的線性關系。

2.3 儀器精密度實驗 結果顯示，SD峰面積RSD為0.07%（n=6），表明上述色譜法精密度較高，滿足磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑含量測定要求。

2.4 重復性實驗 結果顯示，磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑樣品平均含量為97.54%，RSD為0.49%（n=6），表明本方法重復性較好。

2.5 中間精密度實驗 將1.7項下與1.9項下實驗共12個實驗結果合并計算，平均含量為98.53%，RSD為1.12%（n=12），見表1。結果表明，本法中間精密度良好。

2.6 加樣回收率實驗 結果顯示，低、中、高3個級別質量濃度SD平均回收率為101.90%，RSD為0.98%（n=9），見表2。

表1 中間精密度實驗結果

表2 加樣回收率實驗結果

2.7 溶液穩定性實驗 對照品和供試品溶液SD峰面積RSD分別為0.39%和0.11%。結果表明對照品溶液、供試品溶液在配制完成后8 h內均穩定。

2.8 耐用性實驗結果 實驗結果表明，色譜條件作適當變化后，對測定該自制制劑中SD含量結果未產生顯著性影響，表明本法耐用性良好，見表3。

表3 耐用性實驗結果(%)

3 討論

檢測波長的選擇：對SD乙腈溶液進行紫外掃描，紫外圖譜顯示SD最大吸收波長為268 nm。根據《中國藥典》2015年版二部,磺胺嘧混懸液含量測定項下SD的檢測波長為260 nm[8]。進一步探索磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑高效液相色譜圖中的出峰情況，發現在260 nm波長下SD峰型尖銳，缺SD陰性對照樣品的高效液相色譜圖表明SD出峰處其他原輔料無干擾，分離度能達到要求。故選定260 nm為本研究的檢測波長。

提取方法的選擇：根據SD的理化性質[9]，SD弱堿性，不溶于水，選擇稀HCl作為SD提取溶劑。同時，在實驗過程中發現油相黏度較大，且體積占比小，無法與水相有效分離，故選用乙酸乙酯作為油相分散劑。用稀HCl對油相進行反復提取，結果表明該方法能夠將制劑中的SD提取完全，回收率良好。

本實驗建立HPLC測定磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑中磺胺嘧啶含量的方法，提高了該制劑含量測定的專屬性。通過對高效液相色譜法的精密度、重復性、耐用性、回收率等重要參數進行考察，結果表明，HPLC測定本品時精密度、重復性、耐用性、回收率均良好，且該法簡便、快速、準確，為醫院制劑磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑中磺胺嘧啶的含量測定方法提供了科學依據。