60Coγ射線全身照射大鼠尿液的非標記定量蛋白質組學分析

向嘉琪，孫佳麗，2，王成芳，劉青杰，田 梅，

(1．中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088；2．北京市通州區疾病預防控制中心，北京 101100)

隨著射線裝置和核技術的廣泛應用，發生核事故或核災難的可能性正在增加。輻射意外事故發生時，需要對人群進行是否受照、受照劑量估計或分類等評估。傳統的外周血淋巴細胞染色體畸變分析等生物劑量測定方法實驗周期長且分析復雜，難以應對大規模人群受照的劑量估算，組學技術因其快速、高通量的特點受到廣泛關注。蛋白質組學(proteomics)作為系統生物學的重要組成之一，旨在大規模研究蛋白質在時間和空間中的表達、結構和功能。蛋白質組學提供了對蛋白質整體、動態、網絡水平的研究方式，為后基因組學的發展提供了更廣闊的前景。

蛋白質組學可通過檢測不同組織器官、血液或尿液等生物體液來研究輻射引起機體內不同蛋白質表達水平的變化，進而研究輻射對機體的影響。尿液樣本有易大量獲得、非侵入性的特點，且在腎臟中主要由血液過濾形成，不僅能避免血液對蛋白質的穩態調節影響，還能同時反映血液和泌尿系統的功能狀態，是臨床診斷和篩選生物標志物非常有優勢的研究材料。本研究采用非標記(label-free)定量蛋白質組學技術鑒定Coγ射線全身照射后大鼠尿液蛋白，并對照射組與對照組相比差異表達蛋白進行生物信息學分析，旨在研究輻射對大鼠蛋白質水平的影響，為輻射生物標志物的發現、輻射影響機體生理功能的研究以及臨床診斷及治療提供理論基礎和備選分子靶標。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器有：毛細管高效液相色譜儀(Ultimate 3000，美國Thermo Fisher Scientific)；電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質譜儀(Orbitrap FusionLumosTribridMass Spectrometer，美國Thermo Fisher Scientific)；真空離心濃縮儀(Concentrator plus，德 國Eppendorf)；分析 天 平(Sartorius BP211d，瑞士Sartorius)；低溫高速離心機(Microfuge 22R Centrifuge，美 國Beckman Coulter)；掌上離心機(D1008，美國Scilogex)；渦旋儀(MX-S，美國Scilogex)；恒溫培養箱(BPH-9042，上海一恒科學儀器有限公司)。

1.1.2 主要試劑

RIPA裂解和提取液，BCA蛋白測定試劑盒均購于Thermo Fisher Scientific公司；乙腈購于Fisher Chemical公司；甲酸、碳酸氫銨、碘乙酰胺和二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)均購于Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶購于Promega公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine，TEMED)購于Amresco公司；考馬斯亮藍購于北京索萊寶公司。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠30只，雄性，體質量(200±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SYXK(京)2016-0006，在北京大學醫學部實驗動物科學部飼養，屏障環境使用許可證SYXK(京)2016-0041。實驗前適應性飼養1周，30只大鼠隨機分為3組，分別為陰性對照組(0 Gy)和1、5 Gy照射組，每組10只，每只大鼠分別置于單獨的代謝籠飼養。本研究已通過中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所實驗動物倫理福利委員會審查。

1.3 照射方法

大鼠用運輸盒固定后運送至北京輻射中心，采用Coγ射線進行單次全身照射，源強130 TBq，源靶距84 cm，照射視野面積30 cm×30 cm，劑量率1.0 Gy/min，3組劑量分別為0、1、5 Gy。

1.4 樣品采集及處理

照射后第1和第3天，使用代謝籠分別收集每只大鼠尿液，按照射劑量和取樣時間分別記為

X

Gy_

X

d組樣品，樣品置于離心管中，分裝后于-80°C冰箱儲存備用。

1.5 質譜上樣前樣品處理

1.5.1 蛋白提取

在0 Gy_1 d、1 G_1 d、5 G_1 d、0 Gy_3 d、1 Gy_3 d、5 Gy_3 d共6組尿液樣品中各加入1 mL預冷的RIPA裂解和提取液，在4℃下10 000 g離心10 min，將上清液轉移至預冷的1.5 mL EP管中備用。

1.5.2 SDS-PAGE凝膠電泳

將10μL上述蛋白樣品與2.5μL加載緩沖液(5×)混合，沸水中加熱5 min，變性后和marker加入8%分離凝膠孔中電泳1 h 15 min，然后將膠放入考馬斯亮藍染色液中室溫染色1 h，后脫色備用。

1.5.3 BCA蛋白濃度檢測

參照試劑盒操作步驟建立標準曲線，各組蛋白樣品稀釋10倍后檢測562 nm處的吸光度值并計算樣品濃度。

1.5.4 蛋白酶解

將100μg蛋白樣品轉移到新的EP管中，并用50 mmol/L的NHHCO調整至最終體積為100μL；然后加入200 mmol/L的DTT 5μL在55℃下孵育1 h；再加入375 mmol/L的碘乙酰胺5μL，并在室溫下避光孵育30 min；隨后加入6倍體積(約600 μL)預冷的(-20℃)丙酮并在-20℃下冷凍過夜；4℃下以8 000 g離心樣品10 min，倒出丙酮，保留白色沉淀并干燥2～3 min，用100μL 50 mmol/L NHHCO重溶蛋白質沉淀，加入2.5μg胰蛋白酶，在37℃下酶切樣品過夜；酶切后肽段使用自填脫鹽柱脫鹽，于45℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑；肽段用樣品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13 200 r/min，4℃離心10 min，上清轉移到上樣管中，等待質譜分析。

1.6 LC-MS/MS檢測

使用毛細管高效液相色譜分離經過前處理的尿液樣品，并通過MS/MS的峰面積相對定量，得到原始肽段序列后通過肽段指紋圖譜鑒定出相應蛋白質。質譜原始文件使用MaxQuant(1.6.2.10)檢索UniProt-Rattus norvegicus數據庫。

1.7 統計學和生物信息學分析

對搜索數據庫得到的所有蛋白進行分析，篩選差異表達蛋白，將表達變化(fold change，FC)在1.2倍以上或者80%以下(

P

＜0.05)的蛋白歸納為候選差異表達蛋白。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8對上調和下調的蛋白進行GO富集分析，包括生物學過程(biological process，BP)、細胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3大類。對候選差異表達蛋白作KEGG功能富集分析并使用STRING在線軟件建立蛋白-蛋白相互作用網絡。

2 結果

2.1 蛋白質鑒定結果

本實驗檢測了0 Gy_1 d、1 G_1 d、5 G_1 d、0 Gy_3 d、1 Gy_3 d、5 Gy_3 d共6組大鼠尿液樣品。6組樣品質譜法共鑒定出1 069個蛋白。

在兩個不同劑量的γ射線照射后第1和3天，各尿液樣品鑒定出的共同表達蛋白和獨有蛋白如圖1所示。分析不同劑量照射組在照后不同時間的鑒定蛋白質結果如圖1A和圖1B所示，發現照射后質譜法所鑒定蛋白數量隨著劑量增加而增多，5 Gy組照射后第1和3天共同鑒定蛋白數目(388個)多于1 Gy照射組(230個)，此結果表示在本實驗劑量范圍內，輻射劑量越高，輻射暴露損傷越大，蛋白質從血液過濾進腎臟的種類越多。分析照射后不同時間各劑量組的鑒定蛋白如圖1C和圖1D所示，照射后第1天不同劑量組共同表達蛋白數目(273個)高于照射后第3天(223個)，提示照射引起大鼠尿液蛋白表達水平的變化主要發生在照射后早期。對比圖1C和圖1D，僅在1 Gy照射組檢測到的獨有蛋白數量在照射后第1天(59個)多于照射后第3天(37個)，僅在5 Gy照射組檢測到的獨有蛋白數量在照射后第3天(309個)多于照射后第1天(268個)。

圖1 不同劑量γ射線照射后不同時間大鼠尿液鑒定蛋白韋恩圖

與對照組比較，照射后第1天1和5 Gy照射組差異表達蛋白共742個，其中480個表達上調，262個表達下調；照射后第3天1和5 Gy照射組差異表達蛋白共793個，其中559個表達上調，234個表達下調。照射后的第1和3天，1和5 Gy照射組分別與對照組相比均出現差異表達的蛋白279個(742與793交集數目)，其中190個蛋白表達上調，97個蛋白表達下調。此外，照射后第1和第3天，與對照組相比，1和5 Gy組大鼠尿液中表達上調或下調幅度前10位的蛋白見表1和表2。

2.2 差異表達蛋白質的GO功能分析

通過在線GO富集分析工具(DAVID6.8)對篩選出的279個差異蛋白進行GO富集分析，包括3個方面：生物學過程、細胞定位、分子功能。分析結果如圖2所示，顯著富集的差異蛋白主要參與藥物反應、氧化還原過程、老化等生物學過程；細胞主要定位于細胞外泌體、細胞外空間和胞質溶膠等；并發揮蛋白質同源二聚化活性、蛋白質結合和鈣離子結合等分子功能。

表1 不同劑量γ射線照射后不同時間大鼠尿液中表達上調幅度前10位的蛋白

表2 不同劑量γ射線照射后不同時間大鼠尿液中表達下調幅度前10位的蛋白

2.3 差異表達蛋白的KEGG通路分析

將富集的差異表達蛋白進行KEGG信號通路分析，共發現差異蛋白富集參與了30條生物信號通路。富集基因數最多的信號通路如圖3所示，主要涉及抗生素生物合成、谷胱甘肽代謝、碳代謝、代謝途徑、氨基酸生物合成等。

2.4 差異表達蛋白質的PPI分析

為研究差異表達蛋白間的相互作用關系，使用在線工具STRING使蛋白相互作用關系可視化，STRING對蛋白與蛋白之間的相互作用進行了嚴格的評估和整合，包括直接關聯(物理關聯)或間接關聯(功能關聯)。如圖4所示，照射后顯著上調蛋白如GCLM、AZGP1和顯著下調蛋白Ly6d在蛋白相互作用網絡的中心位置，與其他蛋白聯系緊密，彼此相互作用。

圖2 不同劑量γ射線照射后與對照組相比尿液中差異蛋白的GO分析(前10位)

圖3 不同劑量γ射線照射后與對照組相比尿液中差異蛋白的KEGG富集分析(前10位)

圖4 不同劑量γ射線照射后與對照組相比尿液中差異蛋白的蛋白-蛋白相互作用網絡

3 討論

輻射可直接或間接作用于機體組織和細胞引起輻射損傷，導致基因突變，引起氧化應激反應和蛋白表達水平的變化。蛋白質組學技術具有快速、高通量的特點，本研究利用蛋白質組學方法篩選輻射敏感生物標志物，并對其進行了生物信息學分析。

本研究所使用的Label-free定量蛋白質組學技術無需標記蛋白，具有快速、較高通量、性價比高等優點。通過Label-free定量蛋白質組學技術檢測0、1、5 Gy照射組SD大鼠γ射線全身照射后第1和第3天尿液樣本，利用UniProt搜庫軟件共鑒定出1 069種蛋白，比較1和5 Gy照射組相較于對照組的差異表達蛋白，發現差異表達蛋白279種(上調190種，下調97種)。MS/MS質譜峰面積比值結果顯示照射后1天，照射組與對照組相比上調幅度前10種蛋白包括Gusb、Andpro、Lgals3bp、Apbh、Umod、Reg3g、Azgp1、Ctsc、Igg-2a、C9；照射后第3天，上調幅度前10種蛋 白 包 括Mb、Fgb、C3、Cp、Serpina3n、Gsta1、Serpina3n、Alb、Gclm、Hrsp12。此外，照射后第1天，照射組與對照組相比下調幅度前10位的蛋白包括Lgals5、Tmem132a、Manba、Ceacam10、Ly6d、Mb、Hba1、Hbb、Cp、Fcgbpl1；照射后第3天，下調幅度前10位的蛋白包括Egf、Cd59、Ig lambda-2 chain C region、Ggh、LOC100360095、LOC688457、Prss1、Pvalb、Gusb、Ly6d。

根據本實驗室前期在全身照射大鼠血漿中的研究結果以及蛋白質組學在輻射領域的文獻調研，在本實驗中篩選發現的Gusb、Reg3g、AZGP1、Gclm、Ly6d等蛋白可作為候選輻射敏感蛋白進行進一步的研究和驗證。Gusb是一種溶酶體水解酶，廣泛存在于哺乳動物組織和體液中，在不同形式的癌癥壞死部位表達增加，被認為是用于腫瘤診斷和臨床治療評估的可靠生物標志物。Sharma等使用10 Gy的X射線全身照射大鼠，發現尿液中Gusb表達增加。本實驗也發現Gusb照射后第1天，1和5 Gy照射組的表達分別增加27.220和13.726倍，可作為照射后早期候選生物標志物做進一步研究。本研究還發現，Reg3g蛋白在照射后1天照射組表達增加，5 Gy照射組上升3.040倍，1 Gy照射組上升2.202倍，其表達水平有隨劑量增加而上升的趨勢。

Reg3g

基因是輻射敏感性基因，屬于REG家族。Reg3g蛋白在急/慢性胰腺炎、炎性腸病和肝損傷中會表達增高，還有研究發現Reg3g蛋白表達升高會增加胰腺導管腺癌的潛在風險。AZGP1作為脂肪動員因子廣泛存在于體內，參與核糖核酸酶活性調節、受精、黑色素生成調節、抑制腫瘤生成和促進脂解作用，也被視為前列腺癌的潛在生物標志物。本研究結果顯示，照射后1天，1和5 Gy照射組的AZGP1表達分別升高2.096和1.733倍。此外，Gclm是谷胱甘肽合成的第一個限速酶，參與了從L-半胱氨酸和L-谷氨酸合成谷胱甘肽途徑的第一步。本研究中，照射后第3天，1和5 Gy照射組的Gclm表達分別升高1.734和5.034倍，其表達水平有隨劑量增加而上升的趨勢。Ly6d是糖基磷脂酰肌醇錨定的細胞表面蛋白，其功能尚不清楚。Nagano等最近發現，Ly6d在衰老細胞中特異性上調；Kurosawa等發現X射線照射會誘導MCF10A細胞表面Ly6d的表達。本研究中，Ly6d在照后第1天，1和5 Gy照射組與對照組相比分別下降21.1%和31.3%，照射后第3天，1和5 Gy照射組與對照組相比分別下降5.2%和34.9%。上述這些篩選得到的輻射敏感的差異蛋白還需后續實驗進行驗證。

本研究對差異表達蛋白進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析，發現差異表達蛋白參與的生物學過程主要涉及谷胱甘肽代謝過程、對藥物反應、氧化還原過程、老化、氧化應激反應等；差異蛋白主要分布在細胞外泌體、細胞外空間、胞質溶膠、頂質膜、黏著斑等區域，發揮鈣黏蛋白結合參與細胞間黏附、蛋白質同源二聚化活性、受體結合、蛋白質結合以及鈣離子結合等分子功能。KEGG富集分析顯示差異蛋白主要富集在抗生素生物合成、谷胱甘肽代謝、碳代謝、代謝途徑、氨基酸生物合成、糖酵解/糖異生、2-氧代羧酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、蛋白質消化吸收、乙醛酸和二羧酸信號通路上。使用Saito等構建蛋白-蛋白相互作用網絡，發現候選生物標志物如顯著上調蛋白GCLM、AZGP1和顯著下調蛋白Ly6d在蛋白相互作用網絡的中心位置。

綜上所述，本研究采用Label-free定量蛋白質組學技術對Coγ射線全身照射大鼠尿液蛋白進行鑒定和差異表達蛋白的生物信息學分析，為全面了解和研究電離輻射對大鼠尿液蛋白表達水平的影響及其損傷機制、發現輻射敏感生物標志物、篩選腫瘤放射治療敏感生物標志物、研究劑量-效應關系以及進一步探索利用尿液蛋白進行輻射劑量評估提供參考。