三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231與其腦轉移細胞系中mic ro RNA差異表達分析

羅 嬌，張坤馳，周 莉，

(1．貴州醫科大學臨床醫學院，貴州 貴陽 550025；2．上海健康醫學院上海市分子影像學重點實驗室，上海 201318；3．上海健康醫學院附屬周浦醫院腫瘤血液科，上海 201318；4．貴州工程職業學院，貴州 銅仁 554300)

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，是我國女性發病率最高的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤的第5位。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中的特殊亞型，其特點是雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2)均表達缺失。三陰性乳腺癌占原發性乳腺癌的15%～20%，具有高度侵襲性，容易早期復發和轉移；與非三陰性乳腺癌相比，TNBC患者發病年齡輕，腦轉移的發生率更高，疾病進展更快。作為易發生腦轉移的腫瘤之一，乳腺癌患者中腦轉移的發生率為5%～20%。據報道，腦轉移是TNBC患者預后最差的生存指標，其中位生存期約10個月。由于TNBC腦轉移發生發展的分子機制仍不清楚，臨床缺乏早期診斷及預測的分子標志物，目前治療仍以化療為主，但治療效果不佳，預后差。隨著分子生物學的發展，越來越多的microRNA(miRNA)被發現在腫瘤的發生、發展中具有重要作用。miRNA是長度為22～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，大量研究發現其可參與細胞增殖、分化、代謝及凋亡等生物學過程。近期研究發現miRNA的表達變化在乳腺癌腦轉移中具有重要作用，發現miRNA可通過調控細胞的上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)、腫 瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)、腫瘤血管再生等途徑調控乳腺癌腦轉移。因此，研究miRNA在TNBC腦轉移的發生、發展中的作用機制已經成為目前TNBC腦轉移早期診斷及藥物研發的迫切需要。本研究擬采用生物信息技術分析三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231(MB-231)和其腦轉移細胞系MDA-MB-231Brm(MB-231Brm)中miRNA表達譜的差異，篩選出可能與TNBC腦轉移相關的miRNA并分析其靶基因的生物學功能，為進一步研究TNBC腦轉移的發生、發展機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

MB-231和MB-231Brm細胞來自上海健康醫學院附屬周浦醫院的贈予，兩株細胞均在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的L-15培養基，置于37℃、CO體積分數為5%培養箱中培養。通過分析細胞的短串聯重復序列來鑒定細胞系，使用Lonza MycoAlert支原體檢測試劑盒(Lonza公司)檢測支原體污染為陰性。胎牛血清、L-15培養基和胰蛋白酶購自Gibco公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，測序試劑盒TruSeq Small-RNA Sample Prep Kit(Illumina)、Mir-XmiRNA qRT-PCR TB GreenKit和Mir-XmiRNA qRTPCR TB GreenKit(Clontech)均購自上海百賽生物科技有限公司，所有引物均購自Qiagen公司，氯仿、異丙醇、乙醇、滅菌DEPC水均購自上海生工生物有限公司，離心管、細胞培養瓶購自Corning公司。

1.2 儀器

Master cycler PCR儀、冷凍離心機、可調式移液器均購自德國Eppendorf公司，Agilent 2100 Bioanalyzer購自美國Agilent公司，Illumina高通量測序儀購自美國Illumina公司，ABI Step One Plus Real-Time PCR System購自美國Thermofisher公司，Nanodrop ND-1000 UV購自美國Nanodrop公司，細胞培養箱購自Thermo公司，超凈工作臺購自蘇州凈化有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MB-231及MB-231Brm細胞中microRNA的提取

分別取對數期生長的MB-231和MB-231Brm細胞(5×10個)，加入1 mL Trizol，混勻，室溫靜置5 min；加入1/5體積氯仿(200μL)，劇烈振蕩15 s，待溶液充分乳化無分相現象，室溫靜置5 min；12 000 g、4℃離心15 min；緩慢取出離心管，吸取上清液轉移至另一個無RNase的離心管中；加入等體積的異丙醇(500μL)，上下顛倒充分混勻后，室溫靜置10 min；12 000 g、4℃離心10 min，棄上清；加入75%乙醇l mL洗滌，12 000 g、4℃離心5 min，加入20μL滅菌DEPC水溶解沉淀；并用Nanodrop ND-1000分光光度計測量濃度和純度，-80℃保存待用。

1.3.2 小RNA分離、RNA文庫的構建及測序

用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離小RNA(small RNA，sRNA)，并切出長度在18～30 nt之間的sRNA條帶，回收sRNA。隨后，按照TruSeq sRNA Sample Prep Kit說明書上的操作步驟，將sRNA進行PCR擴增，用PAGE膠對PCR產物進行切膠后回收純化，完成RNA文庫的構建。構建好的RNA文庫使用Agilent 2100 Bioanalyzer儀器評估構建的文庫的質量，使用Illumina深度測序技術對構建好的sRNA文庫進行測序，獲得原始數據。

1.3.3 sRNA數據過濾、分類、預測及表達定量

sRNA原始數據通過雜質過濾，去除無插入片段和測得5′接頭污染序列，低質量序列等，獲得干凈序列(clean tags)。將數據過濾后的干凈序列和已知的sRNA數據庫miRBase、Rfam、siRNA、piRNA、snoRNA等進行比對。按照：miRNA＞piRNA＞snoRNA＞Rfam＞其他sRNA的優先級順序將sRNA遍歷注釋。通過和已知的sRNA數據庫比對，鑒定出已知的siRNA，對于未知的sRNA，基于miRNA的前體能夠形成發夾二級結果，使用miRDeep2軟件進行新的miRNA預測。miRNA表達量的計算使用每百萬比配對成對序列(transcripts per million，TPM)做miRNA表達量指標，其中總比配成對read數目用于歸一化表達量數值，從而標準化sRNA的表達水平。

1.3.4 差異sRNA篩選(泊松分布)

差異sRNA的篩選參照差異基因檢測方法，對差異檢驗的

P

值作多重假設檢驗校正，通過控制偽發現率(false discovery rate，FDR)來決定

P

值的域值。FDR值越小，差異倍數越大，則表明表達差異越顯著，差異表達基因默認定義為FDR≤0.001且差異倍數在2倍以上的基因。

1.3.5 GO顯著性富集分析

把差異表達小RNA對應的靶基因向Gene Ontology數據庫(http://www.geneontology.org/)的各個term映射，計算每個term的基因數目，然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達小RNA對應的靶基因中顯著富集的GO條目，參照軟件“GO：TermFinder”(http://www.yeastgenome.org/help/analyze/go-term-finder)。

1.3.6 qPCR驗證

按照Mir-XmiRNA第1鏈合成試劑盒說明書步驟進行逆轉錄。然后按照Mir-XmiRNA qRT-PCR TB GreenKit說明書步驟進行PCR擴增。引物序列見表1。以U6為內參，數據采用GraphPad Prism 5統計軟件進行統計學分析。采用非配對的

t

檢驗，以

P

＜0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

2 結果

2.1 MB-231與MB-231Brm細胞中sRNA種類具有差異性

sRNA測序結果顯示，MB-231與MB-231Brm細胞中包含的已知miRNA、未知miRNA，已知piRNA及未知piRNA數量及比例差別無統計學意義(圖1A)，而在MB-231與MB-231Brm細胞中，miRNA的組分具有差異，MB-231與MB-231Brm細胞中，共有的miRNA有961種，MB-231細胞自有的miRNA有164種，MB-231Brm細胞自有的miRNA有196種(圖1B)。

2.2 MB-231與MB-231Brm細胞中miRNA表達具有差異性

圖1 MB-231與MB-231Brm細胞中sRNA餅狀圖及韋恩圖

sRNA測序結果顯示，MB-231與MB-231Brm細胞中miRNA的表達具有差異性，與MB-231相比，MB-231Brm細胞中，miRNA有145個表達顯著上調，54個表達顯著下調(

P

＜0.05)，1 122個表達未見明顯差異(圖2)。

圖2 MB-231與MB-231Brm細胞中miRNA表達的火山圖

2.3 兩種細胞中miRNA涉及的基因功能

GO功能分析顯示，MB-231與MB-231Brm中，差異表達miRNA所調控的基因與生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)及分子功能(molecular function)均有相關性(圖3)。在生物學過程中，差異表達的miRNA主要參與細胞形成過程、代謝過程、調節生物學過程及對外界刺激的反應；在細胞組分中，差異表達的miRNA的基因功能主要參與細胞、細胞器及細胞膜的形成；在分子功能中，差異表達的miRNA的基因功能主要參與分子的連接、催化活性和轉運活性等功能。

圖3 差異表達miRNA靶基因功能分析

2.4 兩種細胞中差異表達miRNA的篩選

差異表達miRNA的篩選分析顯示，與MB-231相比，MB-231Brm細胞中，miR-199a-3p，miR-103a-3p等表達顯著增加，而miR-1246和miR-4787-3p等表達顯著下降(圖4)。

圖4 差異表達miRNA熱圖

2.5 qPCR驗證結果

qPCR結果顯示(圖5)，與MB-231相比，miRNA-1246在MB-231Brm細胞中表達水平顯著下降，差異有統計學意義(

P

＜0.05)。

圖5 qPCR檢測差異表達miRNA的相對表達

3 討論

據報道，基于微陣列的基因表達譜特別有助于了解乳腺癌的分子事件，如分類、發展、預后和預測。既往研究表明，可以通過微陣列基因表達分析來研究腫瘤轉移到腦中的分子變化。近期，Zhou等對TNBC腦轉移細胞基因表達譜的研究發現了在TNBC腦轉移過程中基因表達發生了顯著變化，揭示了TNBC腦轉移的基因表達譜和分子事件。因此，為研究差異表達miRNA在TNBC腦轉移中的作用，本研究提取乳腺癌細胞系和其腦轉移細胞系中的sRNA，并用PCR構建RNA文庫后經數據過濾，與已知的miRNA數據庫比對，采用miRDeep2對未知miRNA進行新的miRNA預測并用TPM標準化的方法檢測miRNA表達水平。通過sRNA測序發現兩株細胞中已知miRNA、未知miRNA、已知piRNA及未知piRNA的數量及比例無明顯差異；但兩株細胞中miRNA的種類及表達均具有明顯差異，兩株細胞共有的miRNA有961種，MB-231細胞自有的有164種，MB-231Brm細胞自有的有196種；并且與MB-231相比，MB-231Brm細胞miRNA中，145個表達顯著上調，54個表達顯著下調，1 122個表達未見明顯差異。隨后，我們采用GO分析MB-231Brm細胞中差異表達miRNA靶基因的生物學功能。結果顯示，差異表達的miRNA所調控的基因與細胞組分、分子功能和生物過程相關。在細胞成分中，miRNA相關的靶基因主要參與調控細胞、細胞器及細胞膜的形成；在分子功能中，差異表達的miRNA的基因功能主要參與分子連接、催化活性和轉運活性等功能；在生物學過程中，差異表達的miRNA主要參與細胞形成過程、代謝過程、調節生物學過程及對外界刺激的反應。

為了進一步篩選出特異性miRNA，通過差異表達分析發現差異表達顯著的miRNA也具有差異性，與MB-231相比，MB-231Brm中的miR-199a-3p，miR-103a-3p等表達顯著增加，而miR-1246，miR-4787-3p等表達顯著下降。qPCR驗證結果發現與MB-231相比，MB-231Brm細胞中miR-1246表達顯著下降且差異有統計學意義(

P

＜0.05)。miR-1246位于2號染色體的2q31.1處，是唐氏綜合征中

p53

基因的轉錄靶標；有研究報道根據miRNA在腫瘤發生、發展中的不同作用，將miRNA分為腫瘤促進miRNA(oncomiRNA)和腫瘤抑制miRNA(ts-miRNA)，onco-miRNA通常在腫瘤中上調，主要通過降解腫瘤抑制基因促進癌細胞生長；ts-miRNA則在腫瘤中下調，主要以癌基因為降解目標，具有抗腫瘤功能。既往研究發現循環miR-1246在食管癌鱗狀細胞癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、口腔鱗狀細胞癌和高度漿液性卵巢癌中表達上調，能促進這些腫瘤細胞的遷移，且其與腫瘤細胞分化和侵襲密切相關。如：miR-1246在肝細胞癌的高侵襲能力細胞系中的表達明顯高于在低侵襲能力細胞系中的表達，其通過下調細胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)來增強肝細胞癌中腫瘤細胞的遷移和侵襲。miR-1246表達在乳腺癌患者血漿中顯著升高，且侵襲性乳腺癌細胞系MB-231較非侵襲性乳腺癌細胞高表達miR-1246，其通過靶向細胞周期蛋白G2(cyclin-G2，CCNG2)促進乳腺癌細胞增殖、侵襲和耐藥性。既往相關研究報道了miRNA-1246所涉及的一些信號通路及靶基因，其中的一個靶基因為雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶1A(recombinant dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1A，DYRK1A)，其可通過促進細胞增殖和減少細胞凋亡而發揮促癌作用，通過p53-miRNA-1246-DYRK1A-NFAT途徑，抑制

DYRK1A

基因的表達，激活活化T細胞核因子(nuclear factor of activating T cell，

NFAT

)基因，最終導致細胞凋亡，并提出p53-miRNA-1246-DYRK1A-NFAT途徑是腫瘤發生、發展中的新途徑。有研究報道

p

53介導miRNA-1246過表達后可負向調節核因子I/B(nuclear factor I/B，NFIB)來抑制人肝癌細胞的生長。此外，研究證實大多數TNBC中存在

p

53突變，且突變體在各種程度上喪失了正常的

p

53抑癌功能，但也可以通過功能獲得機制獲得致癌特性，其可通過雙重機制促進腫瘤的進展：功能缺失型(腫瘤抑制活性)和功能獲得型(致癌活性)。最近研究發現NFIB在TNBC中的DNA拷貝數和表達水平均顯著增加，并證實NFIB可直接抑制p53突變的TNBC中的

CDKN1A

基因轉錄以促進細胞存活，該基因編碼p21(p53途徑的下游效應分子)，從而導致腫瘤侵襲性生長和腫瘤進展。與既往研究結果不同，本研究發現miR-1246在侵襲性較強TNBC腦轉移細胞系中表達較非腦轉移細胞系顯著下降，結合以上研究結果，推測在TNBC腦轉移細胞系中p53突變可能引起了miR-1246表達下降，通過負向調節NFIB使其表達升高后抑制P21轉錄促進細胞存活，促進腦轉移細胞在腦內的生長，尚需進一步的研究來證實。

腦轉移是一個多步驟、多階段的過程，腦轉移的過程涉及EMT、ECM降解、新生血管形成和血腦屏障的破壞等。miRNA在腦轉移的發生、發展中可分為腫瘤促進miRNA和腫瘤抑制miRNA，具有促進腫瘤生長和抗腫瘤等不同的作用。本研究結果提示，TNBC細胞系及其腦轉移細胞系中差異表達顯著的miRNA在乳腺癌腦轉移中通過調控生物學過程、細胞組分和分子功能等發揮作用；且miRNA-1246在腦轉移細胞系中較非腦轉移細胞系的表達顯著下降。結合既往研究結果，我們推測在TNBC腦轉移細胞系中可能存在p53-miRNA-1246-NFIB-p21途徑來促進細胞存活，從而促進腦轉移細胞在腦內的生長，這仍需進行更深入的探討來驗證。