乳腺癌新輔助化療前后Ki67變化對療效及預后的意義

張玉鈴，吳俊東，潘東岳，陳春發，

(1．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院信息科，廣東汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院乳腺中心，廣東 汕頭 515041；3．廣東省乳腺癌診治重點實驗室，廣東 汕頭 515041)

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NACT)是局部晚期乳腺癌的標準治療模式，它可以降低原發腫瘤大小提高可手術率及保乳率，也可以降低腋窩淋巴結分期采取前哨淋巴結活檢從而避免腋窩淋巴結清掃。NACT還可以提供理想的體內藥敏試驗模型，在治療中越來越被臨床醫師所接受。目前無論何種化療方案，臨床試驗中發現10%～35%的乳腺癌病人對NACT不敏感，這就意味著這部分病人不僅未能從化療中獲益，而且還獲得了化療藥物的毒副作用。因此，盡早發現有效的療效預測因子一直是臨床工作者關注的熱點。

Ki67是增殖細胞中表達的一種核抗原，表達于細胞周期除G0期以外的其他各期，是目前檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一。高表達Ki67的腫瘤細胞增殖活躍，而化療藥物對增殖活躍的細胞殺傷力更強。Vincent等認為Ki67可作為乳腺癌NACT的敏感性指標，腫瘤細胞增殖率的降低比腫瘤的縮小更能反映腫瘤對化療的敏感程度。而Von Minckwitz等則認為在NACT期間Ki67水平下降的患者具有更好的結果，甚至比化療前Ki67基線水平較低的患者的預后更好。因此，本研究探討NACT前后Ki67的變化能否作為NACT療效和預后預測因子，為臨床乳腺癌NACT尋找早期預測因子提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院2009年12月—2013年9月收治的乳腺癌患者。所有患者化療前原發灶均經空芯針穿刺病理診斷為浸潤性乳腺癌，有可評價病灶，無遠處轉移，有配對的NACT前穿刺標本和NACT后手術切除標本。符合條件的患者共有104例，其中女性103例，男性1例。年齡28～80歲，中位年齡51歲。TNM分期參照第7版國際抗癌聯盟(International Union Against Cancer，UICC)和美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)標準。所有患者血常規、心臟、肝臟和腎臟功能均正常，就診前未接受過化療、內分泌治療或放射治療。

1.2 治療和臨床療效評定標準

NACT方案主要為TEC、CEF-T及FEC等方案，其中HER2陽性患者接受新輔助靶向治療有2例。TEC方案：多西他賽75 mg/m，靜脈滴入，第1天(d1)；表柔比星80 mg/m，靜脈滴入，d1；環磷酰胺500 mg/m，靜脈滴入，d1；21 d為1個周期。CEF-T方案：環磷酰胺500 mg/m，靜脈滴入，d1；表柔比星100 mg/m，靜脈滴入，d1；氟尿嘧啶500 mg/m，靜脈滴入，d1；21 d為1個周期；3個周期后序貫給予單藥多西他賽100 mg/m，靜脈滴入，d1，21 d為1個周期。FEC方案：氟尿嘧啶500 mg/m，靜脈滴入，d1；表柔比星100 mg/m，靜脈滴入，d1；環磷酰胺500 mg/m，靜脈滴入，d1；21 d為1個周期。完成4～6個周期后根據具體情況(患者意愿及化療后腫瘤大小、腫瘤與乳腺體積比)行改良根治術或保留乳房手術?；颊咝g后繼續完成化療療程、放射治療及內分泌治療，HER2陽性的患者根據患者意愿和經濟狀況使用曲妥珠單抗治療。

在治療前及術前進行乳腺超聲或者核磁共振檢查，同一患者在化療前后用同一方法測量比較，以乳腺原發腫瘤為可測量靶病灶，記錄其最大徑線，采用實體瘤療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)2009年1.1版標準評估療效。臨床完全緩解(clinical complete response，cCR)：所有目標病灶消失；臨床部分緩解(clinical partial response，cPR)：治療后目標病灶長徑之和縮小≥30%；臨床疾病進展(clinical progression disease，cPD)：病灶長徑之和增加≥20%或出現新病灶；臨床疾病穩定(clinical stable disease，cSD)：病灶長徑之和縮小但未達cPR或增加但未達cPD。cCR+cPR評價為治療有效，cPD+cSD為治療無效。

1.3 免疫組織化學檢測

采用免疫組化EnVision方法檢測乳腺癌組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progestrogen receptor，PR)、人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)和Ki67的表達。ER、PR和HER2的具體檢查方法和判定標準參考文獻[9]。Ki67染色評分根據乳腺癌國際Ki67工作組指南。Ki67指數的比例取決于1 000個腫瘤細胞中陽性細胞總數的百分比(至少500個腫瘤細胞)，陽性細胞數＜14%為低表達，≥14%為高表達，此數值是基于乳腺癌分子分型的界限標準及相關文獻。患者的手術標本中Ki67表達數值比活檢標本中的數值降低定義為下降組，數值一樣或升高定義為未下降組。根據ER、PR、HER2和Ki67不同的表達狀態，將乳腺癌分為5種不同的分子亞型，即Luminal A型[ER和(或)PR陽性，HER2陰性且Ki67＜14%]、Luminal B1型[ER和(或)PR陽性，HER2陰性而Ki67≥14%]、Luminal B2型[ER和(或)PR陽性，HER2陽性]、三陰型(ER、PR和HER2均為陰性)和HER2過表達型(ER和PR陰性而HER2陽性)。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0統計軟件分析。計量資料采用Wilcoxon檢驗，計數資料組間比較采用

χ

檢驗或Fisher"s精確概率檢驗；用Kaplan-Meier方法進行生存分析；Log-rank檢驗進行生存率比較。

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NACT前后乳腺癌組織Ki67的表達

免疫組織化學染色結果顯示乳腺癌組織中的Ki67主要表達于腫瘤細胞核(圖1)。NACT前后Ki67的表達情況見圖2，化療前Ki67低表達有13例(13/104，12.5%)，高表達有91例(91/104，87.5%)；化療后Ki67低表達有39例(39/104，37.5%)，高表達有65例(65/104，62.5%)?；熀驥i67出現降低65例(65/104，62.5%)，不變20例(20/104，19.2%)，升高19例(19/104，18.3%)，經過NACT后Ki67表達顯著下降(

P

＜0.001)。

圖1 新輔助化療前后乳腺癌組織HE染色和免疫組化Ki67表達(×400)

圖2 新輔助化療前后Ki67表達變化

2.2 NACT前后Ki67表達變化與乳腺癌患者臨床病理特征的關系

如表1所示，NACT前后Ki67下降和未下降兩組在年齡、月經狀態、腫瘤T分期、臨床分期、ER、PR、HER2和化療方案等差異均無統計學意義(

P

＞0.05)。腋窩淋巴分期越高的患者化療后Ki67越容易出現下降，N0～1、N2和N3組分別占46.2%(12/26)、79.5%(31/39)和56.4%(22/39)(

P

=0.015)。化療前Ki67高表達的患者經NACT后Ki67更容易出現下降，為69.2%(63/91)(

P

＜0.01)。NACT后Luminal B1、Luminal B2、三陰性和HER2過表達型比Luminal A型的Ki67表達更容易出現下降，分別占73.9%(34/46)、64.3%(9/14)、69.2%(9/13)、47.8%(11/23)和25.0%(2/8)(

P

=0.045)。亞組分析結果顯示，Luminal B1和三陰性亞型的乳腺癌患者NCAT后Ki67表達顯著下降(

P

＜0.001和

P

＜0.019)，而Luminal A、Luminal B2和HER2過表達亞型的患者Ki67下降不顯著(圖3B)。這可能與Luminal A型患者對化療不敏感，而Luminal B2和HER2過表達亞型的患者在本研究中行新輔助靶向治療甚少有關。本研究的結果顯示(圖3A)，聯合蒽環和紫杉醇的化療方案與單用蒽環相比，Ki67表達下降更明顯(

P

＜0.01)。臨床療效判定cCR+cPR組Ki67下降占68.6%(59/86)(

P

=0.005)，NACT前后Ki67下降值與臨床療效相關系數為0.302(

P

=0.002)，見圖4，說明NACT后Ki67下降與臨床療效相關。

表1 乳腺癌患者臨床病理特征與NACT前后Ki67變化的關系

圖3 新輔助化療前后Ki67表達情況

圖4 新輔助化療前后Ki67表達變化與臨床療效的相關性

2.3 隨訪結果

采用電話及門診進行隨訪，從明確診斷第1天開始，局部復發指同側乳腺或區域淋巴結復發，遠處轉移指臨床或影像學結果出現轉移灶。無病生存期(disease-free survival，DFS)指從明確診斷的第1天起至第1次復發或轉移的間隔，總生存期(overall survival，OS)指從明確診斷的第1天起至死亡或末次隨訪的間隔。隨訪截止時間為2019年12月31日，以最后一次隨訪仍存活的時間按截尾數據處理。隨訪中位時間為70.5個月(5至128個月)。全組復發或轉移46例(46/104，44.2%)，其中腦轉移3例，肺轉移18例，肝臟轉移9例，骨轉移4例，胸壁復發5例，患側鎖骨上或腋窩復發7例，54例患者死亡(51.9%)。

2.4 生存情況

NACT后Ki67下降組和未下降組的平均DFS分別為(90.69±5.89)和(63.86±7.88)個月，Ki67下降組的中位DFS率明顯高于Ki67未下降組，差異有統計學意義(

P

=0.027)。其中Ki67下降組和Ki67未下降組的5年DFS率分別為68.1%和44.5%(圖5A)。NACT后Ki67下降組和Ki67未下降組的中位OS分別為(93.00±11.37)和(69.00±15.71)個月。盡管Ki67下降組的中位OS率高于Ki67未下降組，但差異無統計學意義(

P

=0.171，圖5B)。

3 討論

圖5 新輔助化療前后Ki67下降組和Ki67未下降組的生存分析

探索化療療效和預后生物標志物一直是臨床的研究熱點，而NACT的應用給乳腺癌患者提供了機會。尋找有效的生物標志不僅可以縮短療效評估時間，而且可以減輕化療帶來的毒副作用。Ki67作為在乳腺癌中被廣泛應用的指標，特別適用于NACT治療前、治療中及治療后療效的動態評價。高表達Ki67的乳腺癌患者常顯示更好的化療反應，但目前尚沒有一個明確的Ki67界限值評估NACT療效和預后。有學者通過對比新輔助內分泌治療和NACT前后Ki67表達水平的變化，發現高表達Ki67的患者經過化療后Ki67下降更明顯。因此，本回顧性研究通過對比NACT前后Ki67表達水平的變化了解其是否能作為預測乳腺癌NACT療效和預后的預測因子。

本研究結果顯示Ki67高表達的患者NACT后Ki67表達水平明顯減少。出現這種現象可能是高表達Ki67的乳腺癌腫瘤細胞增殖更加活躍，而化療藥物對增殖活躍的細胞的殺傷力更強，這可能也是高表達Ki67的患者化療后臨床和病理完全緩解率更高的原因。本研究結果顯示淋巴結分期越高經NACT后Ki67表達水平越容易出現下降。淋巴分期高的患者往往惡性程度也高，Ki67常處于高表達狀態。正是這樣，經NACT后Ki67表達就容易出現下降。報道稱Ki67表達水平能夠預測乳腺癌各亞型的化療敏感性，本研究結果也顯示不同乳腺癌分子分型經過NACT后Ki67的下降存在差異。Luminal B1和三陰性與Luminal A、Luminal B2和HER2過表達亞型相比，Ki67表達更容易出現下降。一般認為三陰性和HER2陽性的患者惡性度高，腫瘤細胞常常檢測出高的Ki67數值，而Luminal B1型Ki67表達也比Luminal A型高。因此，這些高增殖狀態的癌細胞更容易遭受化療藥物的破壞，這可能就是不同的乳腺癌亞型對化療敏感差異的一個原因。我們的研究結果顯示Luminal B2和HER2過表達亞型的患者中Ki67下降不顯著，出現這種情況的原因可能與本研究中行新輔助靶向治療的患者較少有關?；谏厦娴慕Y果，我們認為乳腺癌分子分型中高表達Ki67的患者經化療后Ki67表達更容易出現下降。

患者對化療藥物敏感性高，或經NACT后出現臨床或病理完全緩解常預示療效也較好。本研究結果顯示臨床療效判定cCR和cPR組患者經NACT后Ki67下降更明顯，并且與NACT后Ki67表達的下降相關。說明NCAT后Ki67下降與臨床療效相符合，Ki67表達下降組的療效優于Ki67表達未下降組，此結果與國內外研究學者結果一致。鑒于本研究中入組的患者大多數為局部晚期的患者，在這類患者中，Ki67下降組與療效具有相關性。但經過NCAT后Ki67表達具體下降多少才有療效，尚需進一步研究。本研究的結果也顯示，聯合蒽環和紫杉醇的化療方案與單用蒽環相比，Ki67表達下降更明顯。說明聯合蒽環和紫杉醇方案化療的療效比單用蒽環的好，這也符合目前乳腺癌指南的推薦方案。因此，對于局部晚期乳腺癌的新輔助化療，聯合蒽環和紫杉醇化療應是首先推薦方案。

多基因檢測顯示Ki67是乳腺癌復發的主要危險因子，高表達Ki67的患者容易出現復發和轉移。本研究結果顯示NACT前后Ki67未下降的患者更容易出現復發或轉移，而Ki67下降組的患者的無病生存率優于Ki67未下降組。出現這種結果可能是由于高表達Ki67的乳腺癌細胞對化療更敏感，經過化療后更容易出現Ki67表達下調，出現復發和轉移的幾率減少。最近的研究顯示經過NACT后，殘留腫瘤組織中Ki67表達水平與預后相關，而Ki67表達減少的預后更好。雖然本研究結果顯示Ki67下降組和Ki67未下降組的患者的OS差異無統計學意義。出現這種原因主要是OS由全部治療手段、時間決定的，由于不同的分子分型后續的治療方法不同，預后也不同，這可能是導致本研究中OS無統計學差異的原因。如果單純評估一種分子分型，結論可能不同。鑒于本研究入組的患者不多，經過分子分型亞組分析后樣本量較小可能會影響統計檢驗效能，希望以后能獲得更大樣本量的驗證。

綜上所述，Ki67作為乳腺癌病理常規檢查，特別是準備行NACT的患者，它的變化能提供療效和預后的預測信息。對于局部晚期的患者，NACT后Ki67下降的患者療效和預后可能更好。本研究結果不僅能指導臨床工作中NACT患者療效和預后的評價，而且能為我們下一步研究NACT前后Ki67表達短期是否會下降、能否早期預測療效和預后提供理論基礎。