CXCR-2在食管鱗癌組織中的表達及其與MMP-9、VEGF的相關性研究

范玉宏，周海豐，范 爽，王立坤，侯雅雄，，劉 博

(1．河北北方學院附屬第一醫院病理教研室，河北 張家口 075000；2．河北北方學院附屬第一醫院普通外科，河北 張家口 075000；3．河北北方學院附屬第一醫院超聲醫學科，河北 張家口 075000；4．河北北方學院附屬第一醫院病理科，河北 張家口 075000)

我國食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)較為高發，其發病率和死亡率一直居高不下，年均新增病例達到21萬例，死亡率達到30%。占同期全球食管癌新增及死亡病例近一半，防治形勢不容樂觀。90%以上的食管癌為鱗狀細胞癌。由于其發病隱匿，早期無明顯癥狀，且缺乏有效的篩查方法，大部分患者診斷時為中晚期，并伴有局部或遠處轉移，無法行根治性切除，且術后的高復發率和轉移率亦是影響其治療的重要危險因素。有研究表明趨化因子及其相關受體在多種腫瘤的發生發展、浸潤和轉移中發揮重要作用。CXC趨化因子受體2(CXC chemo-kine receptor 2，CXCR-2)作為最重要的趨化因子受體家族之一，其配體為CXCL-1、CXCL-2等炎癥趨化因子，參與骨髓來源單核細胞的募集和分化，而CXCR-2在食管鱗癌中的表達及預后評估鮮有報道。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)主要功能是對細胞外基質和基底膜進行有效降解從而增強癌細胞侵襲和遠處轉移的能力。腫瘤通過分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導血管生成，從而使腫瘤生長、轉移，VEGF的過表達可以被認為是預后不良和侵襲性腫瘤表型的標志。由于CXCR-2對靶基因的調控作用具有時序特異性，癌組織中MMP-9、VEGF的異常表達是否由CXCR-2的表達異常所致，目前尚未見報道。本研究通過檢測CXCR-2與MMP-9、VEGF mRNA和蛋白在兩組中的表達，探討其在食管鱗癌產生中的作用和三者的相關性，并分析CXCR-2的表達對食管鱗癌的輔助診斷意義。

1 材料與方法

1.1 標本

2016年12月—2019年12月于河北北方學院附屬第一醫院行食道鱗癌手術的患者70例，其中男性41例，女性29例，年齡44～75歲，中位年齡為58歲。術中留取癌組織并且距腫瘤邊界5 cm以外的正常癌旁組織標本(經術后病理證實為正常組織)。所有患者術前均未接受放射治療，化療及靶向治療。所有手術切除的標本在離體后30 min內收集，分成兩部分，一部分迅速放入含RNA later的凍存管內，于4℃冰箱過夜后轉入-20℃冰箱保存；另一部分用福爾馬林固定，然后制成蠟塊保存。標本及資料收集均經患者本人知情同意，此研究獲得河北北方學院附屬第一醫院倫理學委員會同意并批準。

1.2 試劑和儀器

Trizol RNA試劑盒購于天根生物有限公司；RNA逆轉錄試劑購于日本Takara公司；熒光定量PCR試劑購于美國ABI公司；CXCR-2、MMP-9、VEGF和GAPDH引物由上海生工設計合成，全自動電化學發光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010，DEPC水購于美國Sigma公司，兔抗人CXCR-2單克隆抗體、MMP-9、VEGF抗體均購自英國Abcam公司，二抗購于美國Proteintech Group公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 總RNA提取及c DNA合成

參照Trizol使用說明抽提癌組織及正常癌旁組織的總RNA，溶于無RNase水中，測定抽提RNA濃度，將總RNA逆轉錄為cDNA，-20℃儲存。應用miRNA提取分離試劑盒提取上述組織的miRNA，檢測其純度和濃度后，應用miScript II RT試劑盒將其逆轉錄成cDNA，-20℃保存備用。

1.3.2 實時熒光定量法

引物設計參考相關文獻：CXCR-2，正向5′-ATCTCTTCGACTACTCA-3′，反向5′-GTAGACCAGGACGCTTTTGTT-3′；MMP-9，正向5′-GGGACGCAGACATCGTCATC-3′，反 向5′-TCG TCATCGTCGAAATGGGC-3′；VEGF，正向5′-GGCC TCCGAAACCATGAACT-3′，反向5′-TCGTGATGATT CTGCCCTCCG-3′，內參GAPDH，正向5′-GTCAAGG CTGAGAACGGGAA-3′，反向5′-AAATGAGCCCCAG CCTTCTC-3′。反應條件設定：95℃預變性10 min；95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環。根據系統生成的樣本

C

值，采用2法進行分析，計算CXCR-2、MMP-9和VEGF的相對表達水平，每個樣本均設3個復孔。

1.3.3 免疫組化檢測CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達情況

蠟塊標本切成4μm厚度切片，常規進行脫蠟水化，再用3%HO孵育5 min后修復抗原，滴加10%正常山羊血清，37℃孵育15 min，倒去血清，滴入一抗，37℃孵育60 min；PBS緩沖液沖洗后，加入二抗，37℃孵育30 min，滴入工作液，37℃孵育30 min，DAB顯色后染色液孵育20 s；然后用中性樹膠封片處理。在顯微鏡20倍視野中計算細胞的陽性百分率并采集圖片：陽性細胞≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；根據染色強度評分為：未染色為0分，低度染色為1分，中等染色為2分，高度染色為3分；兩項評分的乘積為最終的評分，總積分≤3分為陰性，＞3分為陽性，由病理科兩位高年資主任醫師閱片，雙盲評估，根據其評分的平均值判定結果。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 食管鱗癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達水平

本研究采用qPCR檢測食管鱗癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達水平，結果見圖1，可見CXCR-2 mRNA在癌組織中的相對表達水平為1.75±0.42，顯著高于癌旁組織的0.90±0.21，差異有統計學意義(

t

=9.058，

P

＜0.01)；MMP-9和VEGF在癌組織中的相對表達水平分別為1.84±0.40和1.79±0.38，均顯著高于二者在癌旁正常組織中的0.85±0.22和0.83±0.20，差異均有統計學意義(

t

值分別為10.195和10.377，均為

P

＜0.01)。

圖1 qPCR法檢測食管組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF mRNA的相對表達水平

2.2 免疫組化檢測CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達水平

免疫組化檢測的結果見表1和圖2。癌組織中CXCR-2蛋白陽性表達率為84.29%(59/70)，明顯高于癌旁正常組織37.14%(26/70)，差異有統計學意義；(

χ

=18.441，

P

=0.000)；MMP-9和VEGF蛋白在癌組織中的陽性表達率分別為80.00%(56/70)和77.14%(54/70)較正常癌旁組織41.43%(29/70)和35.71%(25/70)均明顯升高，差異均有統計學意義(均為

P

＜0.01)。

表1 CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白在食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(n=70)

2.3 食管癌臨床病理指標與CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達的關系

癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達與臨床病理指標的相關性分析結果見表2，可見CXCR-2、MMP-9和VEGF的表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和肝轉移有關(

P

均＜0.05)。CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達水平越高，TNM分期越高。伴癌旁轉移和遠處轉移的患者三者的表達程度明顯高于未轉移的患者(均為

P

＜0.05)，而CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達水平與腫瘤大小無明顯相關(均為

P

＞0.05)。

圖2 免疫組化檢測兩組食管組織中CXCR-2、MMP-9、VEGF的表達情況(SP法，×400)

表2 癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達與臨床病理指標的關系

2.4 癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達的相關性

CXCR-2與MMP-9、VEGF蛋白表達的相關性分析結果見表3，可見CXCR-2表達水平與MMP-9、VEGF表達呈正相關關系(

r

分別為0.488和0.491，均為

P

＜0.01)。

表3 在癌組織中CXCR-2與MMP-9、VEGF蛋白表達的相關性

2.5 CXCR-2表達對食管鱗癌的診斷意義

ROC曲線分析結果見圖3，可見CXCR-2診斷食管鱗癌的AUC值為0.938，95%可信區間為(0.908，0.972)。提示CXCR-2表達對腫瘤的診斷具有較高的準確性，其臨界值為0.77，在最優截斷點敏感度和特異度分別為91.2%和80.9%；漏診率和誤診率分別為9.0%和19.2%。

3 討論

圖3 CXCR-2表達水平判斷食管鱗癌的ROC曲線

食管鱗癌作為最常見和致命的惡性腫瘤之一，死亡率高居第6位，發病率排名第8位，其發病率呈逐年上升的趨勢。食管癌主要分為食管鱗狀細胞癌和食管腺癌，我國以食管鱗狀細胞癌最為常見。由于目前缺少十分有效的治療手段，且食管癌經手術切除后容易發生復發和轉移；雖然隨著診斷和治療技術不斷 完善，但食管癌預后仍然極差，5年生存率僅約為10%。而食管鱗癌的侵襲與轉移機制是研究食管鱗癌發生發展的重要環節，對于提高食管鱗癌的早診早治率和生存率具有較大的社會價值。

有研究表明趨化因子超家族和其相關受體在多種實體腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮必不可少的重要作用。研究證實，以CXCR-2為代表的趨化因子及其受體廣泛分布在人體諸多組織中，其在機體感染、創傷、異常增殖和免疫排斥等多種病理生理過程中對感染源的清除、創傷的加速愈合、異常增殖細胞的殺滅和異物清除等方面發揮重要作用。近年來CXCR-2在腫瘤組織中的作用逐步為廣大醫師所熟知，癌細胞可使CXCR-2的表達上調，且CXCR-2不但不抑制癌細胞的致瘤活動，反而促進腫瘤的發展。

CXCR-2

基因定位于人染色體2q35上，包括2個內含子和3個外顯子，已有研究證實人體多種惡性腫瘤存在CXCR-2表達，且CXCR-2表達與腫瘤轉移明顯相關，在腫瘤細胞的生長、遷移和浸潤過程中起著重要的作用。有學者研究證實CXCR2可增強腫瘤細胞內MMP-9蛋白表達和膠原酶活性，進而促進腫瘤細胞向遠處轉移能力和體內微血管密度的增加。MMPs也稱為基質蛋白，屬于一組鋅依賴性蛋白，是可以分解各種功能性蛋白和糖蛋白的酶，介導細胞表面或細胞之間大分子的破壞，這是腫瘤侵襲的重要早期步驟，MMPs還具有血管生成活性，并參與腫瘤發生和原發性腫瘤生長的早期階段，有研究顯示，腫瘤侵襲性與MMPs高表達有關，患者生存期的縮短與之有著直接的聯系。MMPs中最具代表性的是MMP-9，其具有降解細胞表面或細胞之間大分子的能力，同時可誘導間質中脈管的生成，增強癌細胞的惡性生物學行為。

VEGF

基因位于人6號染色體，是內皮促分裂原和血管生成刺激物，是腫瘤的生長、浸潤、侵襲過程中的重要環節。

研究通過qPCR方法對兩組中CXCR-2的表達進行分析，發現在癌組織中CXCR-2的表達較正常癌旁組織明顯升高，且臨床病理指標分析表明CXCR-2的表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期、肝轉移、淋巴結轉移顯著相關。進一步的Pearson相關性分析結果提示CXCR-2在腫瘤組織中的表達與MMP-9、VEGF表達呈明顯正相關性，這與以上報道結果基本相似。這提示上調CXCR-2的表達可能依賴于靶向調控MMP-9、VEGF的過表達，從而促進腫瘤的浸潤及轉移能力，促使食道癌的發生和發展。

在本研究中，我們還采用受試者工作特征曲線分析了CXCR-2的表達對腫瘤的診斷意義，結果顯示CXCR-2具有較好的預測價值，可作為食管鱗癌的一個診斷預測指標。經過分析其臨界值為0.77，即在這一臨界值下所作出的診斷具有較高的參考價值。考慮到食管病變組織標本的不易獲得性、難保存性，在后續研究中，我們將進一步探究食管病變患者血液組織中CXCR-2的表達情況，分析血液中CXCR-2表達對于食管癌早期篩查、早期診斷的意義和價值。此外，我們還將應用熒光素酶報告基因載體實驗繼續研究CXCR-2與MMP-9、VEGF的靶向關系。

綜上所述，CXCR-2、MMP-9、VEGF在食管癌組織中顯著高表達，其表達水平與食管鱗癌患者的TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關，且CXCR-2表達水平對其診斷有重要預測價值。進一步探索CXCR-2在食管鱗癌發生過程中的通路機制，將為食管鱗癌的早期診斷、早期治療提供新的思路。