血小板生成調(diào)節(jié)和人工制備的研究進(jìn)展

張競(jìng)予，張雨杭，于 兵，陳 費(fèi)，朱海英，胡以平，，汪 超，

(1．海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200433；2．海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員一大隊(duì)，上海 200433)

血小板源于循環(huán)系統(tǒng)中巨核細(xì)胞的無(wú)核胞質(zhì)，通過(guò)釋放儲(chǔ)存在胞內(nèi)的血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)等細(xì)胞因子至受傷部位參與損傷修復(fù)和血管生成等過(guò)程，因此是止血、免疫、炎癥等方面不可或缺的角色。血小板可以在血液中循環(huán)7～10 d，濃度大概為(1～3)×10/L。在臨床上，血小板減少癥、血小板增多癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血等疾病與血小板缺陷有關(guān)。患者對(duì)血小板的需求與日俱增，而捐獻(xiàn)者數(shù)量卻相形見(jiàn)絀。另外，血小板輸注產(chǎn)品的可用性、有效性是有限的。首先是產(chǎn)品壽命有限，血小板僅有7～10 d的壽命，捐獻(xiàn)者來(lái)源的血小板難以長(zhǎng)時(shí)間保存；其次，輸注血小板還存在人類(lèi)白細(xì)胞或血小板抗原引起的免疫排斥反應(yīng)、細(xì)菌或病毒感染等多種潛在風(fēng)險(xiǎn)。

因此開(kāi)發(fā)新型人工血小板及其輸注產(chǎn)品以及改良血小板生產(chǎn)、輸注技術(shù)具有廣闊的前景。本文著眼于人工生產(chǎn)血小板的來(lái)源和其中多個(gè)環(huán)節(jié)，結(jié)合與之相關(guān)的研究進(jìn)展，以期為人工血小板的臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

1 血小板的產(chǎn)生

1.1 巨核系細(xì)胞及體內(nèi)血小板的生成

巨核細(xì)胞是數(shù)量稀少的多倍體骨髓大細(xì)胞，僅占有核細(xì)胞總數(shù)的0.02%～0.05%，是血小板生成的前體細(xì)胞，體內(nèi)平均每個(gè)巨核細(xì)胞在其生命周期內(nèi)能生成約2 000個(gè)血小板。

骨髓在巨核細(xì)胞和血小板的生成中具有戰(zhàn)略性地位。巨核細(xì)胞在骨髓中分化成熟，大體分為以下幾個(gè)階段。首先，造血干細(xì)胞分化成骨髓祖細(xì)胞，而后進(jìn)一步增殖分化成紅細(xì)胞祖細(xì)胞(megakaryocyte erythroid progenitor，MEP)，MEP在細(xì)胞因子和趨化因子等的作用下發(fā)育成紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和單核細(xì)胞等多類(lèi)型細(xì)胞的集落形成單位。如早期和晚期紅系祖細(xì)胞，即爆增性紅細(xì)胞集落生成單位(burst forming unit-erythrocyte，BFUE)和紅細(xì)胞集落形成單位(colony forming unit-erythrocyte，CFU-E)，并進(jìn)一步分化成紅細(xì)胞。巨核細(xì)胞系的集落形成單位主要是CD34的早期爆增性巨核細(xì)胞(megakaryocyte，MK)集落形成單位(BFU-MK)和巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-MK)。BFUMK增殖速度較快，并可發(fā)育成體積較小的CFU-MK，增殖后形成二倍體巨核細(xì)胞前體細(xì)胞(megakaryocyte progenitor，MKP)。MKP僅有DNA復(fù)制和發(fā)育成熟的能力，但不具備分裂能力，免疫學(xué)標(biāo)志為CD34、CD41、CD42、CD61。MKP進(jìn)行2次核內(nèi)復(fù)制，于八倍體時(shí)期成熟。成熟巨核細(xì)胞的分界膜系統(tǒng)(demarcation membrane system，DMS)具有溶酶體、致密顆粒、α顆粒等各種類(lèi)型顆粒，細(xì)胞質(zhì)縱向伸展即可形成血小板前體。

巨核細(xì)胞成熟后，由骨髓成骨處遷移到血竇處，在剪切應(yīng)力等生物循環(huán)力的作用下，在細(xì)胞最突出端釋放血小板(圖1)。

1.2 肺在血小板形成中發(fā)揮重要作用并決定體內(nèi)含量

肺每小時(shí)生產(chǎn)約1 000萬(wàn)個(gè)血小板。有研究人員將離體培養(yǎng)的鼠巨核細(xì)胞注入受體小鼠內(nèi)，將肺作為血小板的檢測(cè)部位。結(jié)果顯示，輸注巨核細(xì)胞后，新生血小板具有正常的表面標(biāo)記和生理功能，釋放量增加了近100倍。這顯示了肺在巨核細(xì)胞功能活性和血小板形成中的重要地位。

圖1 血小板生成示意圖

Lefrancais等在視頻顯微鏡下觀(guān)察小鼠肺微循環(huán)，發(fā)現(xiàn)大量巨核細(xì)胞在其中釋放血小板。也有研究利用熒光標(biāo)記技術(shù)，觀(guān)察到巨核細(xì)胞釋放的血小板主要存在于肺循環(huán)中。這些研究為肺是血小板生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位提供了直接證據(jù)。

1.3 血小板生成相關(guān)調(diào)節(jié)因子

體內(nèi)，巨核細(xì)胞生成和血小板生成過(guò)程由包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、胞外基質(zhì)分子在內(nèi)的多種物質(zhì)調(diào)控。血小板生成素(thromboopoietin，TPO)是刺激巨核細(xì)胞增殖和分化的主要細(xì)胞因子，IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、GM-CSF等對(duì)TPO刺激巨核細(xì)胞的增殖和分化起輔助作用。

然而體外培養(yǎng)條件下，TPO起抑制前血小板形成作用。其原因是IFN-γ(interferon-γ)與阻礙TPO競(jìng)爭(zhēng)受體c-MPL，降低了人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC)分化形成巨核細(xì)胞和進(jìn)一步生成血小板的能力。Eltrombopag是一種合成小分子，起激動(dòng)c-MPL的作用，但由于其作用位點(diǎn)與TPO不同，故Eltrombopag不受IFN-γ的競(jìng)爭(zhēng)作用。此發(fā)現(xiàn)不僅解釋了其在骨髓衰竭綜合征治療中體現(xiàn)的臨床活性，也為體外血小板生成打開(kāi)了新思路。除干擾素發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能外，TGF-β、IL-4也是巨核細(xì)胞生成和血小板生成的抑制因子。鋅指結(jié)構(gòu)蛋白GATA-1在巨核細(xì)胞發(fā)生的早期發(fā)揮作用，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NF-E2)則在巨核細(xì)胞發(fā)生的晚期發(fā)揮作用。這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)巨核細(xì)胞的增殖、分化及血小板生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也起到重要的作用。

2 人工血小板來(lái)源

尋找可靠血小板的來(lái)源一直是血小板制備技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一，研究已經(jīng)證實(shí)和應(yīng)用的血小板來(lái)源主要可分為細(xì)胞與非細(xì)胞兩類(lèi)：如可通過(guò)對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)、脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSCs)、人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人CD34細(xì)胞等的誘導(dǎo)，從而分化分離、生產(chǎn)制備血小板。另一非細(xì)胞方案則致力于人工制備技術(shù)，主要生產(chǎn)以功能為導(dǎo)向的人工血小板，如多肽復(fù)合物、聚合物納米顆粒等。

血小板的制備在已有可靠來(lái)源的基礎(chǔ)上，相應(yīng)的微流模型和生物反應(yīng)器為成功實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)提供了重要保障。

2.1 細(xì)胞來(lái)源

2.1.1 hiPSCs

hiPSCs具有較高的可用性和相對(duì)較少的倫理爭(zhēng)議，被認(rèn)為是體外生產(chǎn)血小板的最佳選擇。hiPSCs是巨核細(xì)胞的潛在來(lái)源。有研究表明

c-MYC

癌基因的瞬時(shí)表達(dá)對(duì)人皮膚來(lái)源的iPSCs產(chǎn)生血小板起關(guān)鍵作用。在一系列體外和體內(nèi)試驗(yàn)中，由hiPSCs獲得穩(wěn)定的可擴(kuò)增的巨核細(xì)胞祖細(xì)胞系(immortalized megakaryocyte progenitor cell lines，imMKCLs)，通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)原癌基因B細(xì)胞特異性鼠白血病毒插入位點(diǎn)-1(B cell specific maloney murine leukemia virus integration site-1，BMI-1)和原癌基因

BCL-XL

，抑制c-MYC瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，imMKCLs可以高效地分化為成熟巨核細(xì)胞，并可以產(chǎn)生CD42b血小板，并且在膠原蛋白支架(一種用于細(xì)胞生長(zhǎng)的新型支架)幫助下進(jìn)一步提高血小板的產(chǎn)量和純度。

hiPSCs的優(yōu)點(diǎn)是可以直接通過(guò)基因工程技術(shù)制備無(wú)人類(lèi)淋巴細(xì)胞抗原(human lymphocyte antigen，HLA)的血小板前體，患者在接受此類(lèi)產(chǎn)品時(shí)，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)較輕。但也有小鼠體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)表明，與正常巨核細(xì)胞相比，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的巨核細(xì)胞(iPSC-MKs)體積更小、倍性更低、半衰期更短、釋放的血小板更少。因此，如何優(yōu)化人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的高效能應(yīng)用值得進(jìn)一步探索。

2.1.2 ADSCs

ADSCs于脂肪組織中有豐富儲(chǔ)存，能分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。此前Matsubara等已經(jīng)實(shí)現(xiàn)體外3T3-L1前脂肪細(xì)胞系向巨核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。Ono-Uruga等進(jìn)一步的研究也表明脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞能通過(guò)分泌內(nèi)源性TPO誘導(dǎo)巨核細(xì)胞生成血小板。最新的研究則通過(guò)倒置培養(yǎng)法獲得了人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞系(a human adipose-derived mesenchymal stromal/stem cell line，ASCL)，簡(jiǎn)化了體外制備人工血小板的操作，為體外大規(guī)模生產(chǎn)血小板提供了選擇。因此，ADSCs作為非供體依賴(lài)型血小板生產(chǎn)的候選細(xì)胞具有廣闊前景。

2.1.3 hESCs

hESCs具有分化成所有血細(xì)胞前體的潛力，常用于探索生理造血過(guò)程，是制備巨核細(xì)胞和血小板的理想“原料”。胚胎干細(xì)胞與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞OP9共培養(yǎng)，并加入TPO、IL-6和IL-11，可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化，從中獲得大量功能性巨核細(xì)胞。Gaur團(tuán)隊(duì)利用遺傳學(xué)方法研發(fā)了一個(gè)OP9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。在該培養(yǎng)系統(tǒng)中，可以誘導(dǎo)hESCs分化成巨核細(xì)胞，并在血小板激動(dòng)劑的作用下，產(chǎn)生具有關(guān)鍵功能位點(diǎn)的類(lèi)血小板。

胚胎干細(xì)胞囊技術(shù)是一種獲得能夠釋放血小板的巨噬細(xì)胞的新方法。在胚胎干細(xì)胞囊內(nèi)，Takayama等將hESCs與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)，并為分化提供合適的微環(huán)境，由此獲得了大量成熟巨核細(xì)胞，為高效生產(chǎn)血小板打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.1.4 CD34細(xì)胞

造血干細(xì)胞是分化成巨核細(xì)胞的前體細(xì)胞，是體外血小板生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞，CD34是造血干細(xì)胞的分型之一。多項(xiàng)研究證實(shí)了利用造血干細(xì)胞生產(chǎn)功能性巨核細(xì)胞和血小板的可行性。其中，小分子616452可從臍帶血(cord blood，CB)或骨髓(bone marrow，BM)樣本中誘導(dǎo)分離出人CD34細(xì)胞，且Huang等發(fā)現(xiàn)小分子616452誘導(dǎo)巨核細(xì)胞分化的能力比TPO更好。小分子抑制劑對(duì)CD34細(xì)胞來(lái)源巨核細(xì)胞的形成與成熟也有一定影響。體外試驗(yàn)顯示Src激酶抑制劑(SU6656)、Rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑(Y27632)和極光B蛋白激酶抑制劑(AZD1152)等多種小分子能夠增強(qiáng)巨核細(xì)胞多倍體化程度。這對(duì)體外誘導(dǎo)生成巨核細(xì)胞和血小板，并用于臨床輸注具有十分積極的作用。

Six等對(duì)分別來(lái)源于臍帶血和外周血的CD34細(xì)胞生成巨核細(xì)胞和血小板的能力進(jìn)行了比較。與外周血來(lái)源相比，臍帶血來(lái)源的CD34細(xì)胞生成的巨核細(xì)胞多倍體化程度更低、產(chǎn)生血小板的數(shù)量更少，但細(xì)胞表面標(biāo)志大致相同。近來(lái)有學(xué)者指出，與外周血來(lái)源的CD34細(xì)胞生成的巨核細(xì)胞相比，白膜層(抗凝血離心后，底部的紅細(xì)胞層與頂部的血漿層之間的一層富含白細(xì)胞區(qū)域)來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)生的血小板更多，并且經(jīng)激動(dòng)劑凝血酶受體激活肽(thrombin receptor activator peptide，TRAP)誘導(dǎo)后，能表達(dá)有效活性標(biāo)志物CD62P。這使得CD34細(xì)胞來(lái)源的血小板的利用方式更為靈活、應(yīng)用范圍更加寬廣。

2.2 非細(xì)胞來(lái)源

2.2.1 血清蛋白

血清蛋白來(lái)源的人工血小板最早可追溯到2001年日本慶應(yīng)和早稻田兩所大學(xué)的工作。他們利用轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞生產(chǎn)目標(biāo)血清蛋白首先解決了血清蛋白具有較強(qiáng)免疫原性的問(wèn)題，使其在人體內(nèi)不會(huì)發(fā)生排異反應(yīng)；隨后，再把直徑僅有5 nm的血清蛋白微粒集中在一起，制成與正常天然血小板大小相近的團(tuán)塊(直徑為1～3μm)，最后在其表面包被糖蛋白，得到與天然血小板具有相同止血作用的人工血小板。

經(jīng)過(guò)多年研究，有關(guān)血清蛋白一類(lèi)的功能性血小板替代產(chǎn)品越來(lái)越成熟。因其來(lái)源充足，制備過(guò)程相對(duì)固定、方便，醫(yī)藥、商業(yè)價(jià)值不斷凸顯。

2.2.2 多肽復(fù)合物

為調(diào)節(jié)血小板異常凝聚，一種單結(jié)構(gòu)域抗體應(yīng)運(yùn)而生，其結(jié)構(gòu)域可以針對(duì)血管性血友病因子(vWF)、vWF A1結(jié)構(gòu)域、活化的vWF的A1結(jié)構(gòu)域、vWF A3結(jié)構(gòu)域、血小板受體糖蛋白Ⅰb(gpⅠb)或膠原蛋白中的任意一種，并可以與血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及纖維蛋白原等血清蛋白片段交聯(lián)。這種抗體性質(zhì)的多肽構(gòu)建體較小、耐受力強(qiáng)、穩(wěn)定性高，口服、舌下含服或經(jīng)鼻、陰道、直腸給藥而不喪失活性。

2.2.3 聚合粒子

聚合物納米顆粒(polymeric nanoparticles，NPs)既可以作為蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子和多核苷酸等親水性大分子的載體，又能進(jìn)一步模擬天然血小板的大小、形狀，并可人工再模擬血小板的表面標(biāo)記，因而被廣泛利用。但限制聚合物粒子應(yīng)用的最大問(wèn)題是其硬度比天然血小板大得多。

“聚合物模板”可以解決這一問(wèn)題。利用位于多層蛋白質(zhì)和聚合電解質(zhì)之上的聚合物核心，通過(guò)沉積、分層、交聯(lián)創(chuàng)建出穩(wěn)定的人工血小板粒子；隨后，將堅(jiān)硬的聚合物顆粒核心溶解，以達(dá)到人工血小板粒子所需要的彈性或柔韌性；最后，選用基于在天然血小板或受損的血管表面研究發(fā)現(xiàn)的活化蛋白質(zhì)(如vWF、gpⅠb)等包被這些粒子，即得到聚合物粒子衍生而來(lái)的人工血小板。這種人工血小板既可以執(zhí)行典型天然血小板的功能，也可攜帶顯像劑以輔助判斷血管是否受損或作為藥物的載體以助力血栓的溶解。

生物活性物質(zhì)衍生的聚合物具有良好的生物相容性功能，近年來(lái)也有一定發(fā)展。殼聚糖-硫酸軟骨素系統(tǒng)就是其中代表之一，該系統(tǒng)可以使血小板在中后期釋放出具有促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化活性的血小板裂解物。

3 用于血小板生產(chǎn)的微流模型和生物反應(yīng)器的發(fā)展——從模仿到創(chuàng)新

對(duì)人工血小板的制備，合適的反應(yīng)器至關(guān)重要。如果能在體外模擬體內(nèi)血小板生成、釋放的環(huán)境，或許能在體內(nèi)血小板生成過(guò)程尚不完全清楚的情況下，在體外生成數(shù)量可觀(guān)的功能性“血小板”。

Li等利用聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(poly-ethylene terephthalate，PET)基質(zhì)捕獲鼠類(lèi)胚胎干細(xì)胞，并使用特定的細(xì)胞因子和細(xì)胞因子抑制劑誘導(dǎo)造血分化，這是有關(guān)3D生物反應(yīng)器的開(kāi)創(chuàng)性工作。隨后，在2009年，Sullenbarger等報(bào)道了第二個(gè)3D模塊化生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器由帶有纖連蛋白和TPO的聚酯和水凝膠支架構(gòu)成，可特異性地誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化成熟并生成血小板。由基質(zhì)膠、vWF、纖維蛋白原、基質(zhì)細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子-1α以及絲狀海綿和透明質(zhì)酸基水凝膠等不同基質(zhì)設(shè)計(jì)的諸多生物反應(yīng)器和微流體系統(tǒng)不斷涌現(xiàn)，物理化學(xué)聯(lián)合機(jī)制近年來(lái)成為在血小板體內(nèi)發(fā)生和體外制備中的研究新熱點(diǎn)，如最新研究表明湍流可促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子等從巨核細(xì)胞釋放，以促進(jìn)血小板脫落。這提示血小板可能只有在物理化學(xué)聯(lián)合機(jī)制下才真正顯示出其循環(huán)和止血的特性，為今后探索微流模型和生物反應(yīng)器的相關(guān)機(jī)制、檢驗(yàn)建模效果，促進(jìn)人工血小板的商業(yè)化生產(chǎn)提供了新的方向和思路。

另一個(gè)體外制備血小板的技術(shù)方向是制備階段性、功能性更強(qiáng)的獨(dú)立體外體系，而并非完全模擬體內(nèi)微環(huán)境。Blin等此前開(kāi)發(fā)了一種具vWF涂層微柱的生物反應(yīng)器，其核心——微柱裝置具有捕獲巨核細(xì)胞的作用，并在高于1 800/s的剪切速率作用下，高效生產(chǎn)血小板。Avanzi等則創(chuàng)造性地分兩階段從CD34細(xì)胞生產(chǎn)出血小板：首先，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)將CD34細(xì)胞分化為成熟的巨核細(xì)胞。然后，將成熟的巨核細(xì)胞接種到網(wǎng)狀Nanex膜上(孔徑2～5μm)，在30～70/s的剪切速率下，可以使每個(gè)巨核細(xì)胞在體外產(chǎn)生1×10個(gè)以上的血小板。該方法雖然得到數(shù)量可觀(guān)的血小板，但其最大的缺陷在于產(chǎn)生的血小板表面可能不具有完整的細(xì)胞表面標(biāo)志物，進(jìn)而無(wú)法保證體外生產(chǎn)的人工血小板的質(zhì)量。

4 展望

近年來(lái)，由于臨床對(duì)血液的需求增加和健康獻(xiàn)血者的數(shù)量有限，血液輸注產(chǎn)品的相關(guān)研究變得越來(lái)越重要。人工血小板是一種很有應(yīng)用前景的臨床應(yīng)用技術(shù)。研究人員從不同細(xì)胞中得到了具有生物活性的血小板，非細(xì)胞來(lái)源的人工血小板也在改善特定功能方面獨(dú)樹(shù)一幟，與此同時(shí)，作為體外生產(chǎn)、輸注血小板的容器、載體——生物反應(yīng)器，近年來(lái)也有重要研究進(jìn)展。

當(dāng)然，人工血小板技術(shù)仍存在諸多問(wèn)題，如相關(guān)生物技術(shù)制備的血小板數(shù)量少、成熟過(guò)程困難、儲(chǔ)存不易、難以達(dá)到臨床應(yīng)用級(jí)別；以功能為導(dǎo)向生產(chǎn)的人工血小板的生物活性、安全性仍有待進(jìn)一步研究。總之，實(shí)現(xiàn)人工血小板的臨床應(yīng)用任重而道遠(yuǎn)，未來(lái)還需對(duì)血小板體內(nèi)、體外的生成調(diào)節(jié)及人工制備技藝與原理等方面進(jìn)行更加深入的探索。