人外周血淋巴細胞微核分析用于估算離體模擬局部照射劑量的研究

陸 雪，田雪蕾，趙 驊，蔡恬靜，田 梅，劉青杰

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088)

目前，對于電離輻射事故(以下簡稱事故)的生物劑量估算都是利用離體建立的劑量效應曲線計算受照人員的全身等效劑量。若受照人員受到的是全身均勻照射，則用現有的辦法估算其生物劑量是較準確的。然而大多數事故造成的是局部照射或不均勻照射。依然采用劑量效應曲線估算全身等效劑量的辦法可能會嚴重低估受照人員的局部劑量，這可能對救治措施的選用產生很大影響。因此建立局部照射生物劑量估算的方法是十分重要且必要的。

一直以來，電離輻射引起的染色體畸變作為“金標準”應用于事故照射的生物劑量估算。然而該指標對分析人員技術水平要求高，耗時耗力，且當受到較高劑量照射時會大大增加獲得中期分裂相細胞的難度。微核(micronuclei，MN)也廣泛應用于事故生物劑量估算。該指標相對于染色體畸變，其計數率較高，形態容易分辨，對分析人員技術水平要求低，可實現自動化分析。因此，有必要探索MN應用于局部照射生物劑量估算的可行性。Dolphin"s模型亦稱不純泊松分布模型，是國際原子能機構(International Atomic Energy Agency，IAEA)推薦的用于估算局部照射劑量的模型之一。該模型可以較好的通過染色體畸變估算離體模擬局部照射劑量。

故此，本研究選用Dolphin"s模型，分析離體模擬局部照射下的人外周血雙核淋巴細胞微核，探索其應用于局部照射劑量估算的可行性，為進一步研究其應用于在體局部照射奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用方便抽樣方法，選取2例健康成年人為研究對象。納入標準：無吸煙飲酒，1年內未接觸放射線，無有毒有害化學物質接觸史，無家族遺傳病史，無急慢性病史，無特殊用藥史。該兩名供血者均為女性，樣本A年齡為40周歲，樣本B年齡為32周歲。無菌條件下每人采集肘靜脈血4 mL，置于肝素鋰抗凝管中。本研究經中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所醫學倫理委員會審核批準(編號LLSC2020-008)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 照射條件

Coγ射線照射由北京市輻照中心提供。照射劑量為1和5 Gy，劑量率為1 Gy/min。照射野面積為25 cm×25 cm，樣本距源距離為78 cm。

1.3 離體模擬局部照射實驗

本研究將樣本A和樣本B的血樣各分為兩部分，一部分不照射，另一部分再分為兩組分別在1和5 Gyγ射線下進行離體均勻照射，劑量率為1 Gy/min。照射后將樣本A及樣本B的已照射及未照射的血樣一共6個樣品放入37℃恒溫培養箱培養2 h，然后將各劑量點照射血樣與同一樣本的未照射血樣按1∶3和3∶1比例混合均勻，最終將一共8個血樣進行外周血淋巴細胞培養。通過細胞分裂阻滯(cytokinesis-block micronucleus，CBMN)法制備MN標本。

1.4 外周血淋巴細胞MN分析

按照《WS/T 187—1999淋巴細胞微核估算受照劑量方法》推薦的方法分析計數MN。每張MN標本分析1 770～3 307個雙核淋巴細胞，記錄MN數量。結果以每1 000個細胞含有的微核數表示。

1.5 統計學處理及劑量估算

2 結果

2.1 離體模擬局部照射情況下人外周血淋巴細胞MN的分布情況

電離輻射誘導的MN的分布若符合泊松分布，則表明細胞受到了均勻照射，若不符合，表明細胞受到了局部照射或非均勻照射。首先對受1和5 Gyγ射線照射的混合血樣中的MN分布情況作出判斷。結果如表1所示，在兩個樣本的1 Gy照射組和5 Gy照射組中，比例為1∶3的混合血樣和比例為3∶1的混合血樣的淋巴細胞微核分布的|

u|

均大于1.96，

σ

/

y

均大于1，說明不符合泊松分布，為過離散分布。且從表格中

σ

/

y

數據可以看出5 Gy照射組的離散程度均大于1 Gy照射組。

表1 離體模擬局部照射情況下人外周血淋巴細胞MN的分布情況

2.2 混合血中受照血的微核率及受照血比例分析

Dolphin"s模型認為在局部照射條件下，染色體畸變在細胞間的分布是受照部分的泊松分布與未受照部分過離散分布的疊加。而對于MN，許多學者認為同樣可以利用Dolphin"s模型計算混合血中受照血的微核率及受照血比例分析。根據公式Ⅰ、Ⅱ得出混合血中受照血的微核率及標準差，根據公式Ⅲ得出混合血中受照血的份額：

式中，

y

為混合血中受照細胞微核率，

x

為觀察到的MN數，

n

為觀察的雙核淋巴細胞數，

n

為不含MN的雙核淋巴細胞數，SE為標準差，

F

為混合血中受照血所占的比例，

D

為照射劑量，

D

取值3 Gy。結果如表2所示，在樣本A的每個劑量點的1∶3混合組和3∶1混合組中，通過公式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ推算出的混合血中受照血比例

F

與實際混合血比例均偏差較大，在樣本B中也觀察到了同樣的結果。

表2 混合血中受照血的微核率及受照血比例分析結果

2.3 人外周血離體照射模擬局部照射的劑量估算

將混合血樣中受照血的微核率代入劑量效應曲線：

y

=17.911 9+33.383 8

D

+42.880 9

D

(

y

為微核率/‰)，估算混合血中受照血的劑量。結果如表3所示，樣本A和樣本B的1 Gy照射組的估算劑量均與實際照射劑量偏差較大，二者5 Gy照射組的劑量估計值與實際照射劑量較接近。

表3 人外周血離體模擬局部照射的劑量估算結果

3 討論

本研究以離體情況下人外周血樣品混合不同比例來模擬局部照射，分析混合血樣中微核率，通過Dolphin"s模型和全身均勻照射劑量效應曲線估算局部照射劑量。結果表明在離體情況下，MN能較好地反映局部照射劑量。

由于本研究是離體模擬局部照射，因此需對混合血中的淋巴細胞MN作泊松分布

u

檢驗，以判斷是否為局部照射。結果發現兩個樣品各組MN的分布均不符合泊松分布，說明將受照血和未受照血混合可以很好的模擬局部照射。研究發現同比例下，人外周血淋巴細胞MN分布的離散程度隨照射劑量的增大而增大。本研究與以往研究相一致，同比例下，離散程度在兩樣本中均為5 Gy照射組大于1 Gy照射組。

由于電離輻射可以造成人外周血淋巴細胞的間期死亡和有絲分裂延遲，因而受照血淋巴細胞的有絲分裂指數低于未受照血淋巴細胞的有絲分裂指數，造成觀察混合血樣本時，其雙核淋巴細胞更容易來自未受照血。本研究發現兩樣本的各組推算的混合血中受照血比例均與實際混合比例偏差較大。盡管如此，仍可以看出在相同劑量下，樣本A的5 Gy照射組及樣本B的1和5 Gy照射組中，3∶1混合組的受照血比例比1∶3混合組更接近設定混合比例。因為混合血中受照血比例增大可以增加受照細胞進入有絲分裂的比例，所以起始受照血占比越高，經過培養后混合血中受照血的比例更接近設定比例。因此當局部照射部位占全身比例越大，或改善培養條件，使受照細胞的有絲分裂指數越高，對估算混合血中受照血微核率，進而估算局部照射劑量越準確。

Dolphin"s模型以分布的特征假設為前提，適用于低LET射線的急性照射條件下的局部照射劑量估算。混合血中受照血的淋巴細胞MN應滿足泊松分布，因此得到混合血中受照血的微核率，即可代入全身劑量效應曲線估算受照血的劑量。有研究認為MN不適合用于估算局部照射劑量。該研究利用1、2和4 Gy X射線照射人外周血淋巴細胞，同樣以照射血和未照射血混合以模擬局部照射，結果發現在各劑量點、各混合比例下MN不能很好地估算局部照射劑量，這可能與其所建立的劑量效應曲線有關。該研究僅用一名女性血樣建立MN劑量效應曲線，是造成最終估算結果偏離實際值的原因之一。MN自發率高，受性別、年齡、疾病史、用藥史和生理狀態等因素的影響。顯然用一例血樣建立曲線是不恰當的。本研究選用衛生行業標準推薦的劑量效應曲線估算受照血劑量。發現無論是樣本A還是樣本B，所估算的劑量均為5 Gy照射組接近實際照射值，而1 Gy照射組的與實際照射值偏差較大。由于MN自身特點可能對小于等于1 Gy的劑量估算并不準確。對于1 Gy以上特別是2 Gy以上的劑量估算的精確度要求較1 Gy以下的要求高，因為2 Gy以上劑量產生的組織反應會帶來很高的健康風險。故在1 Gy以上范圍MN能否很好的估算局部劑量還需增加劑量點以進一步研究。

綜上所述，離體情況下，MN能較好的用于估算局部照射劑量。但由于MN的自發率較高，影響因素多，故對較低局部劑量的估算可能存在較大偏差。另外離體局部照射是對在體局部照射或不均勻照射的簡單模擬，在體局部照射涉及諸多影響因素，因此還需進一步研究建立MN在體局部照射劑量估算的方法。