Nrf2/ARE信號通路在槲皮素抑制異煙肼誘導的肝細胞線粒體氧化損傷中的作用

陳廷玉，陳大印，謝金鹿，高喜仁，盧春鳳，

（1．湖州師范學院醫學院，浙江 湖州 313000；2．佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目前，異煙肼(isonicotinyl hydrazide，INH)仍然是世界衛生組織推薦的一線抗結核藥物中不可替代的首選藥物，但抗結核藥物導致的肝損傷乃至肝功能衰竭是終止結核病治療的主要原因，也是最主要的副作用。因此，尋找有效防治INH肝損傷的藥物成了亟待解決的問題。槲皮素(quercetin，QE)中的黃酮醇，具有清除氧自由基、調節免疫功能及抗炎等多種生物活性及藥理作用。我們前期研究發現槲皮素對INH誘導的肝細胞凋亡及DNA損傷具有一定的保護作用，但其作用靶位與機制尚不清楚。核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件(nuclear erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE)是細胞抗氧化應激的主要信號通路，也是迄今為止發現的最重要的內源性抗氧化應激通路。因此，本實驗以人肝細胞L-02作為研究對象，制備細胞線粒體，從亞細胞器水平揭示槲皮素的作用靶標，探討Nrf2/ARE信號通路在槲皮素抑制INH誘導肝細胞線粒體氧化損傷中的作用，闡明槲皮素對INH誘導肝損傷的保護作用及機制，以期為臨床尋找用于防治抗結核藥物性肝損傷的有效藥物提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

L-02細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；異煙肼、槲皮素、2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)均為Sigma公司產品；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)為Amresco公司產品；2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA)、四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)為Fluka公司產品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甲基磺酰氟(phenylmethysulfony fluoride，PMSF)為Merck公司產品；BCA蛋白定量試劑盒為杭州碧云天公司產品；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；Nrf2、血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)、組蛋白3(histone 3，H3)、β-actin多克隆抗體為Santa Cruz公司產品，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG為Zymed公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組

L-02細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液置于37℃、CO體積分數為5%的培養箱中常規培養，取對數生長期的細胞進行試驗，當加受試物培養時換成不含血清的培養液。將細胞隨機分為陰性對照組(給予等體積的無血清培養基)、INH組(給予10 mmol/L INH)、單獨槲皮素組(給予50μmol/L槲皮素)和槲皮素保護組(給予10 mmol/L INH+50 μmol/L槲皮素)，共4組。細胞按上述分組進行處理，24 h后取細胞培養上清液或細胞進行相關指標檢測。

1.2.2 細胞存活率檢測

采用MTT法檢測L-02細胞存活率。細胞接種在96孔板內，按實驗分組進行處理，每組設3個平行孔。培養24 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20μL，置于培養箱中孵育4 h。吸棄孔內培養上清液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min，使結晶完全溶解。用酶標儀測定每孔

D

(570)值，按下式計算細胞相對存活率。

1.2.3 ROS水平測定

用熒光探針DCFH-DA檢測細胞線粒體ROS水平。細胞按實驗分組處理24 h后，收集各組細胞，加入含250 mmo1/L蔗糖的細胞裂解液3 mL，吹打均勻后于4℃、6 000 r/min離心10 min，取上清于4℃、13 500 r/min離心10 min，所得沉淀即為線粒體。將上述各組線粒體用HEPES緩沖液重懸，并吹打均勻制成線粒體懸液，加入10μmol/L DCFH-DA，37℃孵育30 min后，用多功能酶標儀在激發波長488 nm，發射波長525 nm下，測定其熒光強度。結果以相對值表示，即處理組熒光強度/對照組熒光強度×100%。

1.2.4 MDA含量測定

細胞按實驗分組處理24 h后，收集細胞，采用TBA比色法測定脂質過氧化產物MDA含量。1 000 r/min離心10 min，超聲破碎細胞制成細胞樣品液。用玻璃管取上述樣品液各250μL，加入500μL TCA和250μL TBA，在沸水中水浴45 min。室溫下冷卻，移到5 mL塑料管中，加入1 mL正丁醇抽提。3 000 r/min離心10 min，取上清200 μL加入96孔板中，用酶標儀測定

D

(532)值，根據標準曲線計算樣品中MDA含量。使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.5 GSH含量測定

細胞按實驗分組處理24 h后，收集細胞并裂解制成細胞懸液。應用Beutler改良法測定抗氧化物GSH含量。加入等體積的5%TCA，10 000 r/min離心10 min，沉淀蛋白，收集上清。取上清液50μL，加入750μL反應液[0.1 mol/L PBS和1.0 mmol/L 5,5′-二硫代-雙-硝基苯甲酸(5,5′-dithiobis-nitrobenzoic acid，DTNB)]，充分振蕩混勻，取上清200μL加入96孔板中，在5 min內，用酶標儀測定

D

(412)值。根據標準曲線計算樣品中GSH含量。

1.2.6 SOD活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法測定抗氧化酶SOD活性。細胞按實驗分組處理24 h時間后，收集細胞，1 000 r/min離心10 min。棄上清，用冷PBS重懸細胞，4 000 r/min離心5 min。沉淀中加入200μL裂解液，4℃裂解30 min。9 200 r/min離心5 min，收集上清液。按試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定

D

(550)值，按公式計算樣品中SOD活性。

1.2.7 HO-1蛋白和Nrf2蛋白表達水平檢測

應用Western blot檢測細胞中HO-1蛋白及Nrf2蛋白表達水平。L-02細胞接種在培養瓶中，按實驗分組處理24 h后，收集細胞，加入裂解液在冰上裂解細胞，提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。細胞樣品在100℃水浴中加熱4 min，以充分變性蛋白。每孔上樣10μg總蛋白，在SDS-PAGE中進行電泳分離，然后電轉至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，加入一抗(1∶500)，室溫孵育1 h后，4℃冰箱孵育過夜。用TBST洗膜后，加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜后，用ECL發光液檢測目標蛋白條帶的光密度，采用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件對樣品中目標蛋白進行定量。以β-actin作為漿蛋白內參，H3作為核蛋白內參。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞存活率

MTT法檢測結果見圖1，與陰性對照組比較，INH組L-02細胞的存活率明顯降低，差異有統計學意義(

P

＜0.01)，而單用槲皮素對細胞存活率無明顯影響(

P

＞0.05)，表明槲皮素對L-02細胞無明顯毒性作用；與INH組相比較，槲皮素保護組的細胞存活率明顯增加(

P

＜0.01)，表明槲皮素對INH誘導的細胞損傷具有保護作用。

圖1 細胞存活率

2.2 細胞線粒體ROS水平

由圖2可見，L-02細胞經INH處理后，細胞線粒體ROS相對水平顯著升高，與陰性對照組比較差異有統計學意義(

P

＜0.01)；與INH組相比，槲皮素保護組細胞線粒體ROS相對水平明顯降低，差異有統計學意義(

P

＜0.01)，表明槲皮素可抑制細胞線粒體ROS生成。

圖2 細胞線粒體ROS水平

2.3 細胞MDA含量

由圖3可見，INH組與陰性對照組比較，MDA含量顯著升高(

P

＜0.01)；而槲皮素保護組與INH組相比，細胞MDA含量明顯減少(

P

＜0.01)，表明槲皮素能抑制INH誘導的脂質過氧化反應。

2.4 細胞GSH含量

由圖4可見，與陰性對照組比較，INH處理細胞后GSH的含量明顯降低(

P

＜0.01)；而槲皮素保護組細胞GSH含量明顯增加，與INH組相比差異有統計學意義(

P

＜0.05)，表明槲皮素能提高細胞的抗氧化能力。

圖3 細胞MDA含量

圖4 細胞GSH含量

2.5 細胞SOD活性

由圖5可見，INH組與陰性對照組比較，SOD活性顯著降低(

P

＜0.01)；而槲皮素保護組與INH組比較，SOD活性明顯升高(

P

＜0.01)，表明槲皮素可增加細胞的抗氧化酶活性。

圖5 細胞SOD活性

2.6 細胞質中HO-1蛋白及細胞核中Nrf2蛋白表達

由表1可見，INH組細胞質中HO-1蛋白及細胞核中Nrf2蛋白表達水平明顯增加，與陰性對照組相比差異有統計學意義(

P

＜0.01)；而槲皮素保護組細胞質中HO-1蛋白及細胞核中Nrf2蛋白表達水平高于INH組(

P

＜0.01)，表明槲皮素可進一步激活Nrf2/ARE通路。

表1 細胞質中HO-1蛋白及細胞核中Nrf2蛋白表達水平

3 討論

近年來，線粒體損傷在藥物性肝損傷機制研究中的作用越來越受到關注。線粒體是外源化合物細胞毒性的主要靶點，也是氧化損傷的主要靶細胞器。本研究結果顯示，INH處理細胞24 h后細胞存活率降低，表明INH對L-02細胞具有毒性作用；而INH聯合槲皮素作用后，細胞存活率明顯增高，提示槲皮素對細胞毒性有一定的保護作用。線粒體是細胞產生ROS的主要場所，ROS過多生成可損傷線粒體膜，導致線粒體損傷。本研究發現，經INH處理后，細胞線粒體中ROS水平和MDA含量顯著升高，而GSH含量和SOD的活性顯著降低，表明在本實驗條件下INH可誘導肝細胞線粒體氧化損傷。

槲皮素是植物界分布較廣的黃酮類化合物，具有良好的保肝作用，且使用安全，具有廣闊的臨床應用前景。大量研究表明，槲皮素在體外可通過清除氧自由基、抑制DNA損傷等發揮抗氧化作用。體內實驗證實槲皮素可通過降低脂質過氧化物水平、增加抗氧化物含量及提高抗氧化酶活性對脂多糖誘導的肝臟氧化損傷發揮保護作用。Liu等也證實槲皮素可通過降低MDA水平、增加GSH含量及提高SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性來預防大鼠酒精性肝損傷。近年來，槲皮素經線粒體途徑發揮細胞保護作用越來越引起人們的關注。研究發現槲皮素具有逆轉HO引起的細胞氧化損傷和凋亡作用，其機制與抗氧化和穩定線粒體膜，阻止促凋亡途徑有關，提示槲皮素對線粒體氧化損傷有保護作用。本研究發現，槲皮素能降低L-02細胞線粒體ROS水平和MDA含量，增加GSH含量及SOD活性，提示槲皮素對INH誘導的肝細胞線粒體氧化損傷有抑制作用，可能是通過減少細胞線粒體ROS生成，保護細胞線粒體，增加細胞抗氧化物GSH含量及抗氧化酶SOD活性發揮作用的。

Nrf2/ARE信號通路已成為氧化應激相關疾病預防和治療的靶點。在誘導激活后，Nrf2轉入細胞核中與ARE結合啟動下游II相代謝酶和抗氧化酶基因表達，如HO-1、NQO1、SOD等，促使細胞增強清除ROS的能力，從而發揮抗氧化損傷作用。Liu等研究發現槲皮素可通過激活Nrf2/HO-1通路上調HO-1表達改善鎳誘導的小鼠肝氧化損傷。另有研究發現槲皮素對雷公藤甲素致小鼠免疫性肝損傷具有保護作用，其作用也與激活Nrf2/ARE信號通路有關。本研究發現，L-02細胞經INH處理后，與陰性對照組相比，Nrf2、HO-1蛋白表達明顯增多，而槲皮素保護組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達顯著高于INH組，表明槲皮素誘導更多的Nrf2轉位入核，增加下游靶基因

HO-1

等的表達。Ji等也證實了槲皮素可通過激活p62-Keap1-Nrf2通路，減輕對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)和CCl誘導的線粒體氧化應激導致的肝損傷。因此，我們認為槲皮素可激活細胞中Nrf2/ARE信號通路，提高細胞內SOD、GSH的含量，增強細胞抗氧化損傷的能力，促進線粒體ROS清除，從而抑制INH誘導的肝細胞線粒體損傷。

綜上所述，在本研究條件下，INH可誘導L-02細胞線粒體氧化損傷，槲皮素能夠抑制INH誘導的肝細胞線粒體氧化損傷，其機制可能與槲皮素對Nrf2/ARE信號通路的活性調節相關。