載紫杉醇的透明質酸-熊果酸膠束凍干制劑的制備及質量評價

朱 紅，于英杰，董 優，宋 煜

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從中藥紅豆杉中提取的抗腫瘤活性成分，在多種癌癥的治療上取得了一定的療效［1-2］。傳統紫杉醇注射劑以聚氧乙烯蓖麻油為溶劑，導致藥物相關不良反應較多，患者耐受性差［3-4］。白蛋白結合型紫杉醇通過納米技術，將紫杉醇與人血白蛋白相結合，一定程度上改善了傳統紫杉醇制劑的超敏反應，但存在神經毒性、胃腸道反應、骨髓抑制等不良反應，制約著臨床應用［5］，因此紫杉醇制劑仍需進一步研究開發。本課題組前期以可主動靶向腫瘤細胞膜表面CD44受體的透明質酸［6］為親水端，以在腫瘤高谷胱甘肽微環境中特異性降解的二硫鍵為連接臂，以協同抗癌成分熊果酸［7］（ursolic acid，UA）為疏水鏈段，通過酰胺反應合成了還原敏感型透明質酸-熊果酸偶聯物（hyaluronic acid-cystamine-ursolic acid，HSU），并以它為載體成功負載PTX制成載藥納米制劑，以期實現PTX-HSU膠束主動靶向于腫瘤部位、腫瘤細胞內定位觸發釋藥、協同增效的目標。

由于此種液態的納米制劑常存在粒子聚集、粒徑變大的現象，不利于儲存與運輸［8］，從而限制其臨床應用。采用真空冷凍干燥技術制備凍干制劑是目前解決液態納米制劑不能長期儲存、提高制劑穩定性的最佳方法［9］。本研究擬制備PTX-HSU膠束凍干制劑，對凍干保護劑進行篩選，并考察凍干制劑的理化性質和穩定性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 MS105DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機（德國Christ公司）；JY92-2D超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技公司）；Nicomp380ZLS激光粒度測定儀（美國PSS公司）；LC2030高效液相色譜儀（日本島津公司）；H-7650透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 試藥 PTX對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100832-201603）；PTX原料藥（福建南方制藥股份有限公司，批號：902-1812401）；PTX-HSU膠束課題組自制；甲醇為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 PTX含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-水（75∶25，v／v），柱溫：30℃，流速：1mL／min，進樣量：20μL，檢測波長：227 nm［10］。

2.1.2 標準曲線繪制 精密稱取PTX 2.0 mg，甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，配制成200μg／mL的儲備液。精密量取儲備液適量，用甲醇分別稀釋配制成系列濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μg／mL的PTX對照品溶液，按“2.1.1”項中色譜條件測定，記錄峰面積并繪制標準曲線。

2.2 PTX-HSU膠束凍干制劑制備 在透析法所制備的膠束溶液中加入一定量的凍干保護劑，溶解混合均勻，按2mL／皿分裝，-20℃冰箱預凍24 h后，冷凍干燥即得。

2.3 凍干保護劑種類及濃度篩選 分別以凍干制劑的外觀、復溶性、再分散性、粒徑及復溶后PTX含量變化為考察指標，選擇適合于工業化生產且安全性高的葡萄糖、乳糖、甘露醇作為凍干保護劑，并考察其不同用量（0.5%、1%、1.5%、3%、5%）對PTXHSU納米膠束的保護效果。

2.4 PTX-HSU膠束凍干制劑的質量評價

2.4.1 外觀及復溶性 評價PTX-HSU膠束凍干制劑的外觀及復溶性。

2.4.2 粒徑及zeta電位 PTX-HSU膠束凍干制劑復溶后，取500μL稀釋至5mL，利用激光粒度測定儀（DLS）測定粒徑和zeta電位。

2.4.3 形態學研究 采用滴染法制備透射電鏡試樣。吸取微量載藥膠束溶液滴于銅網上（碳膜面），使用濾紙從邊緣吸去多余溶液，滴加4%的磷鎢酸溶液至銅網染色，1 min后使用濾紙從邊緣吸去多余溶液，在透射電子顯微鏡下觀察膠束的形貌。

2.5 PTX-HSU膠束凍干制劑穩定性影響因素試驗

2.5.1 高溫試驗 PTX-HSU膠束凍干制劑置于密封潔凈容器中，在60℃下放置10 d，在第5、10天取樣，觀察PTX-HSU膠束凍干制劑的外觀，復溶后測定粒徑、多分散系數、電位以及PTX含量變化（第0天溶液中PTX含量定為100%）。

2.5.2 高濕試驗 PTX-HSU膠束凍干制劑置于密封潔凈容器中，放置在25℃，相對濕度為（90±5）%的試驗箱中放置10 d，于第5、10天取樣，觀察外觀，復溶后測定粒徑、多分散系數、電位以及PTX含量變化（第0天溶液中PTX含量定為100%）。

2.5.3 強光試驗 PTX-HSU膠束凍干制劑于照度（4500±500）lx條件下放置10 d，在第5、10天取樣，觀察PTX-HSU膠束凍干制劑的外觀，復溶后測定粒徑、多分散系數、電位以及PTX含量變化（第0天溶液中PTX含量定為100%）。

2.6 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量數據用（±s）表示，采用One-Way ANOVA進行統計學分析。

3 結果

3.1 PTX含量測定 以PTX質量濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程為A＝47193 C＋13167（r＝0.9999）。結果表明，在0.5～20.0μg／mL范圍內線性關系良好。

3.2 凍干保護劑種類及濃度篩選 PTX-HSU膠束加不同凍干保護劑的凍干制劑外觀見圖1。未加凍干保護劑的PTX-HSU膠束凍干制劑表面粗糙，有部分飛絮，質地松散，復溶后PTX含量明顯降低；加入乳糖凍干保護劑之后有略微“結塊”現象，部分坍塌皺縮，復溶后PTX含量略微降低；加入葡萄糖凍干保護劑之后凍干品色澤均勻，部分呈現結構松散的“皸裂”狀，與其他凍干制劑相比復溶性較差；加入甘露醇凍干保護劑之后凍干品表面光潔、飽滿，質地細膩，呈“薄餅”狀，復溶性較好，PTX含量與未凍干前未出現明顯下降。結果表明，加入凍干保護劑后的PTX-HSU膠束凍干制劑PTX含量下降狀況得到改善，加入甘露醇后，膠束凍干制劑外觀相對較好，且PTX含量下降較少，因此選定甘露醇為PTX-HSU膠束的凍干保護劑。為篩選凍干保護劑最佳濃度，進一步考察了不同濃度甘露醇對凍干粉針質量的影響，見表1。結果表明，甘露醇濃度為1%～5%（w／v）時，凍干制劑外觀、復溶性及PTX含量未見明顯差異。因此，最終選擇以1%（w／v）甘露醇作為凍干保護劑。

圖1 凍干保護劑種類篩選

表1 凍干制劑復溶性及PTX百分含量（n＝3，±s）

表1 凍干制劑復溶性及PTX百分含量（n＝3，±s）

凍干保護劑無凍干保護劑乳糖葡萄糖復溶性甘露醇加入量（w／v）—5%5%5%3%1.5%1%0.5%易易難 易易易易易凍干前后PTX含量比／%94.48±0.9095.27±2.6396.31±2.3398.36±2.1299.39±5.3699.28±2.9099.63±2.2494.26±5.18

3.3 PTX-HSU膠束凍干制劑質量評價

3.3.1 外觀及復溶性 PTX-HSU膠束凍干制劑表面飽滿光潔，色澤均勻，質地細膩，復溶后稍加振搖即得淡藍色乳光納米膠束溶液。

3.3.2 粒徑及zeta電位 PTX-HSU膠束凍干制劑復溶后的平均粒徑為（152.8±8.5）nm，多分散系數為（0.105±0.010），zeta電位為（-20.98±3.44）mV（n＝3）。納米膠束尺寸較小，粒徑分布均勻，見圖2。

圖2 PTX-HSU粒徑分布

3.3.3 形態學研究 PTX-HSU膠束的透射電鏡結果如圖3所示，PTX-HSU膠束呈類球狀，粒子在130 nm左右，分布均勻。PTX-HSU膠束通過透射電鏡測定粒子尺寸相較激光粒度測定儀的粒徑變小，推測可能是因為在透射電鏡制樣過程中揮干了水分，膠束的親水性外殼發生皺縮，使得粒子變小。

3.4 PTX-HSU納米膠束凍干制劑穩定性的影響因素試驗 高溫、高濕、強光實驗結果見表2～4。結果表明，在高溫、高濕、強光條件下，PTX-HSU膠束凍干制劑的外觀均無明顯變化。高溫條件下載藥納米膠束PTX含量有所降低，粒徑增大，復溶變得困難；高濕度使凍干制劑的復溶性變差；載藥膠束凍干制劑對光不敏感，各項參數穩定；因此，該凍干制劑應避免在高溫和高濕條件下儲存使用，宜在低溫干燥條件下保存。

圖3 PTX-HSU透射電鏡圖（×100000）

4 討論

液態的納米膠束在長期儲存中可能出現粒子聚集、粒徑變大的現象，通過真空冷凍干燥技術制備膠束凍干制劑可以起到長期保存的作用。然而在冷凍干燥過程中存在藥物隨水分飛散造成成品含量偏低，以及凍干制劑呈現結構松散易吸潮的現象等，因此在凍干物固體含量小于5%時應加入凍干保護劑，保持其理化性質穩定。本研究對乳糖、葡糖糖、甘露醇3種凍干保護劑的凍干效果進行考察，發現加入凍干保護劑后的PTX-HSU膠束凍干制劑PTX含量下降狀況得到改善，推測可能是由于加入凍干保護劑所形成的空間構架保護了載PTX膠束，從而減少了PTX從膠束中滲漏的現象。其中，甘露醇作為凍干保護劑時凍干效果最佳，且在濃度1%～5%凍干效果無差異，最后選擇了1%甘露醇作為PTX-HSU膠束最佳凍干保護劑。

表2 凍干制劑高溫影響因素實驗結果（n＝3，±s）

表2 凍干制劑高溫影響因素實驗結果（n＝3，±s）

時間／d 復溶性0510物理性狀白色餅狀白色餅狀白色餅狀PTX含量比／%100.00±0.0098.77±1.0590.65±1.61粒徑／nm 147.8±0.9185.2±1.8497.7±12.8多分散系數0.117±0.0040.122±0.0150.384±0.049 zeta／mV-15.48±3.29-14.45±3.02-33.10±1.89易難難

表3 凍干制劑高濕影響因素實驗結果（n＝3，±s）

表3 凍干制劑高濕影響因素實驗結果（n＝3，±s）

時間／d 復溶性0510物理性狀白色餅狀白色餅狀白色餅狀PTX含量比／%100.00±0.0096.94±9.8196.60±2.50粒徑／nm 147.8±0.9167.2±0.4165.0±1.5多分散系數0.117±0.0040.122±0.0090.117±0.008 zeta／mV-15.48±3.29-13.30±6.74-19.80±1.18易易難

表4 凍干制劑強光影響因素實驗結果（n＝3，±s）

表4 凍干制劑強光影響因素實驗結果（n＝3，±s）

時間／d 復溶性0510物理性狀白色餅狀白色餅狀白色餅狀PTX含量比／%100.00±0.00101.03±2.5899.05±2.96粒徑／nm 147.8±0.9161.5±1.9151.8±0.9多分散系數0.117±0.0040.110±0.0160.097±0.017 zeta／mV-15.48±3.29-9.74±5.46-20.55±0.78易易易

本研究制備的PTX-HSU膠束凍干制劑復溶后的粒徑在152.8 nm左右，zeta電位穩定在-20 mV左右，zeta電位絕對值較大。其可能原因是HA結構中的-COOH在水中解離為帶負電荷-COO-，使粒子間存在較大的斥力，有利于膠束制劑的物理穩定。高溫條件下納米膠束凍干制劑PTX含量有所降低，粒徑增大，復溶變得困難，推測可能是納米膠束結構遭到部分破壞的原因。因此膠束凍干制劑需儲存在4℃干燥條件下。

本研究制備的PTX-HSU膠束制劑具有較好的理化性質，為繼續開發PTX膠束奠定了良好基礎，下一步我們將對膠束制劑的體內外藥效學狀況進行評價。