烤煙主栽品種K326和Y87成熟期中部葉含氮化合物的差異

張程涵， 趙會納， 余 婧， 余世洲， 許本波， 雷 波*

(1.長江大學 生命科學學院， 湖北 荊州 434025； 2.貴州省煙草科學研究院 煙草行業分子遺傳重點實驗室， 貴州 貴陽 550081)

煙草是我國重要的經濟作物之一，煙葉各種化學成分的含量及其比例影響煙氣質量[1-2]。煙株從土壤或肥料中吸收的硝態氮和銨態氮優先供應煙株的頂葉，再緩慢向下運輸[3]。生物堿、蛋白質、氨基酸等是煙葉中的主要含氮化合物[4-5]，對煙株的生長發育有重要的生理功能，如氨基酸參與構成酶、激素，調控能量代謝和物質轉化[4]，可以平衡氮含量[6]，脯氨酸是一種滲透調節物質，提高煙株的抗逆性[7-8]。此外，含氮化合物是衡量煙葉品質的最重要指標[9]，煙堿影響煙氣的勁頭和濃度，決定煙氣的生理強度[4]；蛋白質會產生類似羽毛燃燒的臭味[10]；氨基酸可以與還原糖在煙葉烘烤、醇化等過程發生美拉德反應，生成多種香氣物質[11]。因此，煙葉中含氮化合物差異對煙株生長和品質評價有重要意義。在成熟期煙株光合能力減弱、分解能力增強，化學成分趨于協調，是煙株生長發育過程中重要時期，而含氮物質含量受遺傳、栽培措施、氣候等多種因素的影響[12-16]，其中品種是彰顯品質特色的關鍵因子[17]。近年來，不少學者采用偏最小二乘法結合均值差異分析判別篩選煙草中差異代謝標記物[18-21]。K326和Y87是我國目前各煙區的主要種植品種，其煙葉質量對我國卷煙工業的效益有一定影響。因此，掌握K326和Y87成熟期煙葉的含氮物質差異，為其精準合理利用與種植調控含氮物質含量提供依據。

1材料與方法

1.1種植地概況

烤煙品種K326和Y87種植于貴州省貴陽市清鎮市盧狄村。施基肥前種植地土壤全氮0.172%、水解氮131.89 mg/kg、全磷0.81 g/kg、有效磷12.48 mg/kg、全鉀27.58 g/kg、速效鉀241.00 mg/kg、有機質34.15 g/kg、pH為4.63，土壤養分含量均在合理范圍，適合種植烤煙。

1.2種植方法

烤煙品種K326和Y87各種植3個小區，各小區種植6行、每行20株、共120株。移栽行距110 cm，株距50 cm。施N量為90 kg/hm2，分2次施入。其中：基施量為63 kg/hm2，用貴州科泰金福肥業有限公司生產的N∶P∶K=12∶12∶24的專用肥，在起壟時條施；追施量為27 kg/hm2，用貴州科泰金福肥業有限公司生產的N∶P∶K=15∶0∶30的專用肥，在移栽后35 d窩施。打頂留葉數為16片/株。其他田間管理措施按當地優質煙栽培技術。

1.3煙葉樣品采集

選擇田間發育良好的煙株，單株掛牌，在成熟期采集每個小區的第8葉位煙葉樣品，去主脈后裝進凍存管立即放入液氮帶回實驗室，將樣品進行真空冷凍粉碎后測定其含氮化合物含量。

1.4測定項目

總糖、還原糖、總氮、蛋白質含量參照文獻[22-24]測定的方法，可溶性蛋白質用南京建成生物工程研究所生產的總蛋白測定試劑盒(考馬斯亮藍法)測定，生物堿參照文獻[25]測定，氨基酸、多胺和銨離子參照文獻[26]的方法測定。

1.5數據處理

采用數據分析軟件SIMCA13.0對K326和Y87煙葉含氮化合物數據進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，采用統計軟件SPSS 16.0的獨立樣本t檢驗對2個品種進行含氮化合物均值比較，并將分析結果在Excel進行整理。

偏最小二乘法分析(PLS-DA)中，VIP值是衡量變量對分類貢獻大小的重要指標，VIP值越大對分類貢獻越大，一般篩選VIP>1.0且均值比較中存在0.05水平或0.01水平差異的代謝物質作為差異代謝物質，試驗采用此方法進行差異含氮物質篩選。

2結果與分析

2.1K326和Y87成熟期中部葉含氮化合物種類

由表1可見，主栽品種K326和Y87煙葉共36種含氮化合物，主要包括生物堿(煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿)、總氮、蛋白質、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺等)、多胺(酪胺、腐胺、苯乙胺等)及銨離子。

表1K326和Y87成熟期中部葉測定的含氮物質

2.2K326和Y87成熟期中部葉的含氮物質差異

由圖1可見，K326和Y87煙葉含氮物質差異明顯，分類明顯。在主成分散點圖上可以明顯的分為2類，一類為K326，另一類為Y87，可篩選K326和Y87煙葉的差異含氮物質。

由圖2可見，對K326和Y87煙葉分類貢獻較大(VIP>1.0)的代謝產物有瓜基丁胺、天冬氨酸、高精米、谷氨酸、酪胺、異亮氨酸、精氨酸、蛋白質、亞精胺、天門冬酰胺、蘇氨酸、γ-氨基丁酸、總氮、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸。

圖1K326和Y87煙葉含氮化合物的主成分散點分布

圖2K326和Y87煙葉含氮化合物的載荷圖分布

2.3K326和Y87成熟期中部葉含氮物質差異的t檢驗

由表2可知，總氮、蛋白質、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸在K326和Y87煙葉間差異不顯著，因此在差異物質篩選中剔除。綜合偏最小二乘法判別分析(VIP>1.0)和t檢驗共篩選了K326和Y87煙葉的差異含氮物質有13種，分別為γ-氨基丁酸、高精米、胍基丁胺、精氨酸、酪氨酸、酪胺、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、纈氨酸、亞精胺、異亮氨酸。

表2K326和Y87煙葉中含氮化合物及其t檢驗

K326煙葉的1種含氮物質(瓜基丁胺)含量極顯著低于Y87，3種含氮物質(高精米、酪胺、異亮氨酸)含量極顯著的高于Y87，9種含氮物質(γ-氨基丁酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、纈氨酸、亞精胺)含量顯著高于Y87。

3小結

試驗發現，K326和Y87成熟期中部煙葉的差異含氮物質主要是氨基酸，共篩選出13種差異氨基酸，其中K326煙葉的1種含氮物質(瓜基丁胺)含量極顯著低于Y87，3種含氮物質(高精米、酪胺、異亮氨酸)含量極顯著的高于Y87，9種含氮物質(γ-氨基丁酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、纈氨酸、亞精胺)含量顯著高于Y87，但K326和Y87煙葉的總氮、蛋白質、生物堿含量差異均不顯著。可能是與2個品種本身的遺傳特性、自身氮素代謝及氨基酸的合成和代謝有關。因試驗為一年單點試驗，可能還存在一定的局限性，在下一步的研究中擬結合轉錄組數據進一步分析，探討K326和Y87煙葉的氨基酸代謝差異及差異原因。