氣相色譜法測定柑橘類果皮揮發油檸檬烯含量的方法研究

邵建群 李青原 李風華 石 晨 王玉記 張 楓

(首都醫科大學藥學院實驗教學中心，北京 100069)

檸檬烯(limonene)屬于單萜類化合物，學名為1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環已烯，為無色或淡黃色的油狀液體。檸檬烯大量存在于柑橘類植物的果皮中，主要以D-檸檬烯形式存在，是一種天然的活性單萜[1-2]。檸檬烯不僅廣泛應用于香精香料領域，由于檸檬烯具有多種生物活性和藥理作用，可以作為止痛祛痰、消炎鎮咳的藥物加以應用[3]。研究[4-6]表明，檸檬烯對很多細菌和真菌都具有較強的抗菌活性；具有較強的抗氧化作用[7-8]，是一種天然的抗氧化劑，可用于食品的保鮮[9-10]。國內外的研究[11-14]還顯示，檸檬烯可以抗腫瘤，具有抑制細胞周期與誘導細胞凋亡及抑制腫瘤細胞的增殖與轉移的作用。檸檬烯廣泛存在于天然植物中，鑒于檸檬烯的多種食用和藥用價值，合理的開發可最大程度地利用這些天然資源。而檸檬烯含量的多少是一個重要檢測指標，檸檬烯的測定方法也有一些文獻[15-16]報道。本文采用水蒸氣蒸餾法先從柑橘的果皮中提取得到揮發油，然后對揮發油中檸檬烯的含量進行氣相色譜的定量分析。按本文所建立的方法，筆者對市場上銷售的多種柑橘果皮提取到的揮發油進行了檸檬烯含量的測定。

柑橘果皮是柑橘類產品的副產物，大量丟棄也會引起環境污染，而要變廢為寶從柑橘果皮中提取其揮發油，檸檬烯就是一個主要監測指標。本文所建立的氣相色譜測定方法，就是為天然檸檬烯原料的進一步開發利用提供質量評價方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

氣相色譜儀(7890B，美國Agilent公司)；自動進樣器(G4513A，美國Agilent公司)；色譜柱 HP-5(J&W GC Columns,30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；BT25S電子分析天平，TE412-L型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；RCTBS025控溫磁力攪拌器(德國IKA公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；電子調溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司 98-1-B型)；LABOROTA 4000-efficient型旋轉蒸發儀(德國Heidolph公司)。

1.2 試劑

標準對照品D-檸檬烯(中國食品藥品檢定研究院)；丙酮、石油醚(60～90 ℃)、無水硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉(均為分析純，北京化工廠)；實驗所用陳皮購于百姓陽光大藥房，其他柑橘類果皮均購于北京市售的果品。

1.3 溶液配制

1.3.1 檸檬烯對照品系列標準溶液的制備

精密稱取檸檬烯176 mg于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解定容，濃度為17.6 mg/mL。準確吸取此溶液0、0.25、0.5、1.25、2.5、3.75、5、7.5 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容并搖勻。此系列標準工作溶液的濃度為0、0.44、0.88、2.2、4.4、6.6、8.8、13.2、17.6 mg/mL。

1.3.2 柑橘類揮發油樣品溶液的制備

分別取不同橘皮各20 g，剪成1 cm×1 cm大小碎片，采用水蒸氣蒸餾方法進行提取。根據文獻[17]報道，在裝有提取物的燒瓶中同時加入氯化銨，能夠改變細胞內外滲透壓，提高檸檬烯的提取率，實驗時加入氯化銨0.7 g。通入水蒸氣連續蒸餾提取2 h，然后把餾出液倒入分液漏斗中，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，每次用10 mL石油醚萃取3次。合并萃取液，加入適量的無水硫酸鈉干燥30 min后，再減壓過濾除去干燥劑。用旋轉蒸發儀把石油醚完全蒸餾出去后，可以得到淡黃色具有柑橘香味的揮發油。稱質量，用丙酮溶解，制成濃度為5 mg/mL的樣品儲備溶液備用。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；氫火焰離子化檢測器(flame inoization detector,FID)；檢測器溫度250 ℃。程序升溫：起始溫度70 ℃，保留16 min，以30 ℃/min升溫至250 ℃，保留1 min。載氣為氮氣，流速1 mL/min；進樣方式為分流，分流比100∶1；自動進樣器進樣量1 μL。

2 結果

2.1 氣相色譜分離結果

按“1.4”項下的色譜條件，標準對照品檸檬烯和柑橘樣品的色譜圖見圖1，檸檬烯的出峰時間為14.374 min。

圖1 檸檬烯對照品和柑橘揮發油樣品的氣相色譜圖

2.2 線性關系

把按照“1.3.1”項下配制成的檸檬烯丙酮系列標準工作溶液，采用“1.4”項下的色譜條件，以1 μL的進樣量自動進樣，進行氣相色譜分析測定。以峰面積y為縱坐標，對照品檸檬烯的質量濃度x(mg/mL)為橫坐標，其線性回歸方程為：y=153.4x-1.223，相關系數r2=0.999 0，圖2為峰面積與濃度關系圖，這表明檸檬烯濃度在0～17.6 mg/mL范圍內有良好的線性關系。

圖2 檸檬烯丙酮溶液峰面積與濃度線性關系

2.3 精密度試驗

按照“1.4”項下的色譜條件，采用自動進樣器，取對照品檸檬烯溶液(4.4 mg/mL)以1 μL的進樣量進樣，測定氣相色譜所得峰面積。日內連續進樣6次，峰面積相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.65%；日間連續進樣6 d，峰面積RSD為1.45%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗

按“1.3.2”制備的樣品溶液，密封4 ℃下放置，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 h后，在設定的色譜條件下自動進樣器進樣，根據氣相色譜所得峰面積的測定值，7 h內的RSD為1.26%，表明供試品溶液在7 h內穩定性良好。

2.5 重復性試驗

取同一批按“1.3.2”制備的供試樣品揮發油6份，在設定的色譜條件下，以1 μL的進樣量連續自動進樣。6份供試樣品揮發油中檸檬烯的濃度和RSD的計算結果詳見表1，表明該方法的重復性良好。

表1 重復性試驗結果

2.6 加樣回收率試驗

取按“1.3.2”制備的揮發油供試品樣品9份，分為3組，每組分別平行3份。各組按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2的比例加入已知量的對照品檸檬烯，在設定的色譜條件下自動進樣器連續進樣，根據峰面積的測定值，計算加樣回收率和RSD值見表2，表明本方法的準確度良好。

表2 加樣回收率實驗結果

2.7 柑橘果皮揮發油檸檬烯的含量測定

取不同產地的柑橘皮，按照“1.3.2”分別制備樣品溶液，按上述氣相色譜條件測定并計算檸檬烯在提取揮發油中的質量百分含量，詳見表3。

表3 柑橘果皮揮發油中檸檬烯的含量結果

3 討論

檸檬烯一般有三種存在形式，分別是D-檸檬烯、L-檸檬烯和 DL-檸檬烯，在柑橘類果皮揮發油中主要以D-檸檬烯存在[1,18]。實驗采用水蒸氣蒸餾法可以有效地提取柑橘類果皮中的揮發油，本研究所建立的氣相色譜測定方法，就是測定D-檸檬烯在揮發油中的含量。由于氣相色譜實驗所用溶劑都是易揮發的，根據多次試驗的經驗，在實驗時待測溶液都應該密封冷藏保存，才能避免因溶劑的揮發而產生的影響，同時也提高了測定的準確度。從圖1可知，實驗所得到的色譜圖中檸檬烯峰形對稱，無雜質峰干擾，分離度好，所以本方法可用于揮發油中檸檬烯含量的定量測定。

根據本研究中14種柑橘果皮揮發油中檸檬烯的測定結果，可以看出檸檬烯在各種柑橘類果皮中的揮發油含量差異較大，含量最高的是從新鮮的砂糖橘皮提取到的，檸檬烯含量為89.63%，曬干后為84.44%，這表明砂糖橘皮曬干后檸檬烯的含量有所降低。另外，從本研究表3的結果中可以看出，我國南方產的砂糖橘、贛南臍橙、小葉桔、南豐蜜桔、沃柑、檸檬果皮的揮發油中都含有大量的檸檬烯。鑒于檸檬烯在食品[19]、農藥[20]、醫藥等領域的應用價值[21-22]，也希望本研究所建立的方法能夠為柑橘類果皮資源的合理利用以及檸檬烯的質控研究奠定基礎。

致謝：本論文獲得“基礎與專業藥學國家級實驗教學示范中心(首都醫科大學)”和“醫學化學與藥學北京高等學校示范性校內創新實踐基地(首都醫科大學)”兩大平臺的支持。