液體活檢在肺結節診療中的應用現狀及前景

李柏鈞 溫昭科

【關鍵詞】 液體活檢;肺結節;游離循環腫瘤細胞;循環RNA;循環腫瘤DNA;腫瘤血小板;外泌體

中圖分類號：R734.2?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.04.013

在全世界范圍內，肺癌是發病率和死亡率居于第一位的惡性腫瘤，且約四分之三的病人在診斷時已處在疾病的晚期，失去了手術機會，5年存活率低[1]。隨著低劑量螺旋計算機斷層掃描在國內外的廣泛應用，大量肺結節的患者被發現，但是肺結節并不等于肺癌，只有5%～10%的肺結節為惡性，而惡性結節如果不進行早期干預，其惡性程度強、病情進展迅速、預后差，如果能在早期對病灶進行手術切除，將會明顯改善肺癌患者的預后[2]。臨床上依據肺結節一般特征如大小、形態、成分比例、密度，以及特殊征象如毛刺樣改變等以判別肺結節的良惡性程度。同時，對于診斷困難的患者進行定期隨訪[3]。然而這些策略不僅增加了患者的經濟負擔，而且加劇了患者的焦慮心理。因此，早期準確地定性診斷肺結節成為臨床面臨的主要挑戰。最常用的肺結節評估手段包括痰脫落細胞學、肺部CT、支氣管鏡檢查、肺組織活檢等[4]。痰脫落細胞學具有無創、經濟等優點，但陽性率非常低。肺部增強CT具有準確、快捷、敏感性較高等優點，但是具有輻射性、嚴格的設備要求等缺點。支氣管鏡檢查是侵入性獲得病理標本的手段，結果的敏感性較低。手術具有可獲得病理標本并消除病灶的優點，但具有手術及麻醉的風險。液體活檢是通過檢驗血液或其他體液（如尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液等），協助臨床對腫瘤等疾病進行診斷、判斷預后、選擇治療方案的一種檢測手段。具有無創、標本易獲得且可重復獲取、能夠動態反映腫瘤基因譜全景等優點，有被廣泛應用于各種腫瘤的診斷及治療方案選擇的潛力。液體活檢包括游離循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體、循環RNA及腫瘤血小板（tumor educated platelets， TEPs）等多項技術。現對液體活檢在肺結節定性診斷中的研究現狀和應用前景進行討論，希望可以為肺結節的定性診斷提供更多選擇和更準確的方法。

1 CTC

1.1 CTC的定義

通常把進入人體外周血的腫瘤細胞稱為CTC。CTC在腫瘤形成過程中因脫落而進入血液循環中，故而對肺結節等肺癌的早期診斷具有重要作用。CTC的優勢表現有以下幾點：①可通過觀察CTC細胞形態確定腫瘤的惡性表型，還可以進行熒光原位雜交和免疫細胞化學等進一步檢測;②可通過CTC的表型鑒定以檢測基因組變化，同時進行體外培養CTC建立CTC細胞系以用于各種體外、體內的功能實驗及藥物篩選[5～6]。因此，CTC在肺癌的個體化治療方面具有巨大潛力。目前，CTC檢測可用的方法包括：上皮細胞因子陽性富集法和白細胞去除法、免疫熒光法、密度梯度離心法、免疫磁珠技術等。

1.2 CTC在肺結節診療中的應用

ILIE等[7]檢測到3%的慢性阻塞性肺疾病患者外周血中含有CTC，當時肺部CT并未發現肺結節，隨后監測1 至4年才發現肺結節，行手術切除后術后病理均顯示均為Ⅰa期肺癌。RIED等[8]發現無癥狀高危因素的人群中外周血CTC陽性率為50%，其中20%的患者在后續的影像學篩查中發現了早期肺癌。這些研究表明，CTC檢測可以先于影像學發現惡性腫瘤的存在。因此，我們可以推測聯合CTC和影像學將提高對肺結節定性診斷的準確率。YU等[9]檢測153例非小細胞肺癌患者與113例對照組患者外周血中CTC，結果發現肺癌患者外周血中CTC明顯增多，其中對Ⅰ期肺癌的敏感性為67.2%。該研究說明液體活檢在肺癌的診斷中是可行的生物標志物，甚至對于在肺部表現為肺結節的Ⅰ期肺癌也具有較高的敏感性，有助于提高肺結節定性診斷的精準度。李金波等[10]回顧性分析58例肺結節患者（良性組22例與惡性組36例），采用配體靶向聚合酶鏈反應法檢測兩組患者的CTC，比較其與癌胚抗原、細胞角蛋白21片段水平差異，結果發現CTC對肺結節的診斷敏感度、特異度分別為84%、86%，同時還發現CTC在治療時的水平與預后具有相關性。丁運等人[11]比較了CTC與癌胚抗原鑒別肺結節良惡性的差別，結果發現CTC比癌胚抗原具有更高的敏感度和特異度，且CTC的高低水平與臨床肺癌淋巴結轉移及術后TNM分期具有相關性。

此外，CTC攜帶了大量肺癌生物信息，在肺癌的發生、轉移中扮演了重要角色，因此對于CTC的充分利用不僅可以提高早期診斷肺癌的可能性，而且可以通過對其攜帶生物信息進一步為肺癌提供精準的治療方案。雖然目前CTC的檢測及分析技術仍有一定局限性，但隨著科技的發展，CTC將在肺結節等肺癌的早期診斷中扮演舉足輕重的角色。

2 ctDNA

2.1 ctDNA的定義

ctDNA是腫瘤細胞凋亡或壞死后釋放出來的遺傳物質，與腫瘤組織DNA具有高度的一致性。研究發現，腫瘤患者體內血漿游離DNA的平均含量約是健康人體的6倍，可作為早期診斷、治療效果評價與治療后臨床隨訪的重要監測指標[12]。目前，ctDNA檢測技術主要包括二代測序技術、數字PCR和等位基因特異性PCR。

2.2 ctDNA在肺結節診療中的應用

2016 年美國食品藥品管理局先后批準了針對非小細胞肺癌患者ctDNA檢測試劑盒[13]和基于NGS檢測技術的ctDNA診斷試劑盒的使用[14]。表明了ctDNA檢測對非小細胞肺癌患者的診斷和治療具有重要的價值。CHEN等[15]前瞻性地收集了58例早期NSCLC患者（ⅠA期、ⅠB期和ⅡA期）的血液和腫瘤樣本，并采用靶向測序方法檢測匹配的腫瘤DNA （tDNA）和血漿ctDNA的體細胞驅動突變基因，發現EGFR、KRAS、PIK3CA和TP53等肺癌常見突變基因在血漿ctDNA和tDNA突變頻繁。該研究證實了檢測人群中血漿ctDNA突變用于肺癌早期篩查、診斷的可行性，并有望在肺結節的良惡性鑒別上發揮用武之地。LIANG等[16]通過比較肺惡性腫瘤和肺良性病變，從組織中了解DNA甲基化特征，最終建立了區分惡性結節和良性結節的診斷模型。該模型有望成為一種非侵入性但敏感的可以區分良惡性肺結節的診斷方法。PENG等[17]通過開展一項多中心研究，對192例可手術的肺部占位性疾病患者切下的組織行組織gDNA與血漿ctDNA的深度基因測序，檢測ctDNA在診斷肺結節方面的價值，結果發現采用血漿ctDNA法檢測時，肺癌敏感性為69%，特異性為96%。而當ctDNA突變與血清生物標志物聯合時，該模型的敏感性和特異性分別提高到80%和99%，其中64%的癌癥患者處于Ⅰ期，肺結節平均直徑2.2 cm（0.5～4.0 cm），敏感性為63%。這些研究均證實了檢測血液中ctDNA有助于肺結節的定性診斷，提高惡性結節的檢出率，早期發現肺癌使患者獲得良好的預后。

綜上，ctDNA不僅可以促進肺癌的精準醫療，用于療效評價、耐藥性檢測和預后評估，還可以在肺結節的早期評估定性中發揮重要作用。

3 外泌體

3.1 外泌體的定義

外泌體是可在血漿、唾液、尿液等多種體液中檢測到的直徑為30～100 nm的細胞外囊泡，可以包含來自其原始細胞的由脂質雙分子層保護的生物活性miRNA、mRNA或DNA，在細胞間通信中發揮作用[18～19]，此外，外泌體在各種溫度和酸堿度中極其穩定，外泌體可能是診斷各類癌癥的潛在生物指標[20]。研究證實在腫瘤的發生和轉移過程中，腫瘤細胞分泌的外泌體發揮了重要作用，在促進腫瘤血管生成，參與腫瘤耐藥性發生、免疫調節、信號傳導等作用[21]。目前，常用的外泌體分離技術如過濾離心法、超速離心法、密度梯度離心法等。分離后進一步通過各種蛋白質和基因檢測手段檢測外泌體的生物信息。

3.2 外泌體在肺結節診療中的應用

外泌體中含多種蛋白質，如鼠類肉瘤病毒癌基因蛋白、表皮生長因子受體、緊密連接蛋白等，這些蛋白與肺癌發生、發展及轉移密切相關[22]。外泌體中含有幾十種有可能成為非小細胞肺癌的特異性生物蛋白及因子[23]，且在肺癌患者的外泌體中微小RNA也具有特異性[24]，因此外泌體是肺癌的重要標志物， 對肺癌的早期診斷極其重要[25]。SANDFELD等[26]證實外泌體膜結合蛋白等外泌體相關蛋白在肺癌患者表達增加且與肺癌患者總體生存時間呈相關性。外泌體還可以作為肺癌治療藥物的藥物載體，提高其藥物的靶向性而增加治療效果[27]。JIN等[28]發現腺癌和鱗狀細胞癌患者的外泌體中具有特異性miRNA。

綜上所述，外泌體可能成為高敏感性、非侵入性的早期肺癌診斷生物標志物，有應用于肺結節定性診斷的價值，但目前已經發表的相關研究仍較少。

4 微小核糖核酸（miRNA）

4.1 miRNA的定義

液體活檢中檢測miRNA是通過在體液（通常是外周血）中檢測miRNA協助腫瘤診療的一種檢測方法，miRNA是具有調控功能的非編碼RNA，大小長為20～25個核苷酸。研究發現，miRNA通過介導轉錄后沉默以調節細胞活性等方面在腫瘤發生、發展及轉移中起關鍵信息傳導作用[29]。許多研究團隊都在尋找腫瘤患者和健康人群中miRNA的差異以便為肺癌早期診斷尋找標記，其中let-7家族、miRNA-21等在肺癌患者中表達具有特異性，可能成為對肺結節進行定性及肺癌篩查或早期診斷的工具[30～31]。miRNA的常用檢測方法包括RT-PCR、微陣列法（microarray）、Northern blot。

4.2 miRNA在肺結節診斷中的應用

通過比較肺癌和正常對照組患者血漿中的多種miRNA，SOZZI等[32]和MONTANI等[33]發現在肺癌患者中miRNA具有較高的特異性，說明了miRNA測定在肺癌診斷中具有較高的應用價值。考慮到單個miRNA對腫瘤發病影響稍小，BIANCHI等建立一個包含了34個miRNA檢測組成的模型[34]，應用該模型可以從無癥狀高危肺癌人群中識別出早期肺癌患者，準確性為80%;還可以區分在肺部CT中發現的高危人群中的肺小結節的性質，在肺結節和肺癌高危人群的篩查中具有巨大潛力。為了闡明肺癌與肺部良性疾病之間miRNA的表達是否存在差異，FAN等[35]對非小細胞肺癌、良性肺結節和肺部炎癥疾病患者血清中的miRNAs進行了研究。結果發現有5個miRNA的比率在非小細胞肺癌組的表達高于良性肺結節組，敏感性為0.70，特異性為0.90。說明miRNAs的比值可作為惡性肺結節的潛在非侵入性生物標志物。

以上研究顯示了miRNA在作為肺部結節診療方面的巨大潛質，但miRNA在定量檢測時存在內參/外參基因的選擇上存在不一致以及各種來源的miRNA在獲取過程中質量和數量的差異較大等等問題。因此，目前miRNA在腫瘤的診療中仍處于臨床前期研究，需要大量更規范研究促使miRNA的臨床應用成為可能。

5 腫瘤血小板（TEPs）

5.1 腫瘤血小板的定義

腫瘤血小板概念指的是機體在與腫瘤細胞對抗過程中，腫瘤細胞和腫瘤微環境釋放的生物分子可能使血小板中發生剪接事件從而形成了TEPs[36]。還有研究發現血小板可以攝取并保護腫瘤的外泌體，使之不被降解[37]。 由于TEPs中含有RNA等生物分子，通過應用測序或者定量分析的手段，就可以獲得腫瘤患者體內這些相應生物分子的組成及其狀態，從而為腫瘤的診療提供參考。因此，TEPs可能作為肺結節定性診斷的生物標志物[37]。

5.2 腫瘤血小板在肺結節診療中的應用

2017 年，有研究通過對非小細胞肺癌進行TEPs檢測，應用粒子群優化（particle swarm optimization，PSO）算法可以有效地從血小板RNA序列庫中選擇RNA生物標記板，在早期和晚期非小細胞肺癌其準確性大于80%[38]。PSO算法是一種為選擇一個穩健的生物標志物集合而用于識別最佳的生物標志物的算法[39]，能夠從血小板RNA測序文庫中有效地選擇RNA生物標志物組。應用PSO算法可使基于TEPs檢測早期和晚期NSCLC的準確度提高，有助有識別早期肺結節的性質。ZU等[40]通過研究血液和富血小板血漿中的整合血小板特征期望建立肺癌的診斷模型并區分肺結節的良惡性，結果發現肺癌患者在全血平均血小板體積、平均血小板體積、富血小板血漿、血小板計數和血小板回收率等多種血小板特征有顯著差異。XING等[41]通過比較小于2 cm的孤立性肺惡性結節與良性結節的血小板源性ITGA2B mRNA水平，肯定了TEPs在鑒別肺結節良惡性方面的能力，測量TEP ITGA2B mRNA有助于臨床醫生在影像學發現的肺結節人群中篩選出惡性結節患者，從而實施個體化的治療，提高早期肺癌患者的總體生存率。

6 小結

肺癌仍然是威脅人類健康的高發病率、高致死率的癌癥，肺結節的發現為早期發現診斷肺癌提供了機會，液體活檢在肺結節診療中發揮著巨大作用，可用于肺結節的定性診斷，進一步促進了肺癌精準醫學的發展。目前，由于技術限制，雖然液體活檢仍存在許多局限性，但是相比于影像學，早期可以在血液中檢測到相應的生物標志物，為人類早期發現腫瘤提供可能性。

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（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-01-29）

（編輯：梁明佩）

基金項目：國家自然科學基金（82060078）;廣西自然科學基金（2016GXNSFAA380196）

作者簡介：李柏鈞，男，副主任醫師，醫學博士，研究方向：胸外科。E-mail：2364313910@qq.com

[本文引用格式]李柏鈞，溫昭科.液體活檢在肺結節診療中的應用現狀及前景[J].右江醫學，2021，49（4）：299-303.