基于網絡藥理學的丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質基礎及作用機制研究

曹新福，李 享，劉紅旭，周明學，2

快速性心律失常是一種常見的心律失常，包括頻發房性期前收縮、頻發室性期前收縮、房性心動過速、室性心動過速、室上性心動過速、心房撲動、心房顫動等。中國大陸室性心律失常的年猝死總人數達54.5萬人[1-2]。目前西醫治療快速性心律失常的方法主要包括以鈉通道阻滯劑、β受體阻滯劑、鉀通道阻滯劑、非二氫吡啶類鈣拮抗劑等為主的藥物治療，以及以射頻消融術和埋藏式心律轉復除顫器植入術等為主的非藥物治療，抗心律失常藥物不良反應較大，且多有致心律失常的副作用，在一定程度上限制了其使用，器械治療有創且價格昂貴，病人不易接受。快速性心律失常屬中醫學“心悸”“怔忡”范疇，國家級名老中醫魏執真教授提出了快速性心律失常關鍵病機為“瘀熱”，治療上首創涼血清熱法，臨證時重用丹皮、赤芍、黃連，在快速性心律失常的治療上效果顯著[3-5]，同時有多項研究表明丹皮-赤芍-黃連具有明確的抗實驗性快速性心律失常作用[6-7]，但其發揮作用的分子機制尚不清楚。本研究嘗試從網絡藥理學角度探尋涼血清熱藥組丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質基礎和可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物成分及靶點的篩選 應用中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)，網址：http://tcmspw.com/，分別以丹皮、赤芍、黃連為關鍵詞檢索出所有化合物成分，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件，篩選化合物成分，另外結合文獻對于未能入選，但是文獻報道有生物活性和藥理作用的也納入候選化學成分，并依托TCMSP中的TargetsInfomation模塊篩選得到相應成分的作用靶點。最后，應用STRING 10.5數據庫(http://string-db.org/)將檢索得到的所有靶點校正為其官方名稱(official symbol)。

1.2 疾病相關靶點的收集及藥物-疾病共同靶點篩選 以“Tachyarrhythmia”為關鍵詞通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，檢索與快速性心律失常相關的靶點，并將結果以EXCEL格式導出。將疾病靶點與藥物成分靶點輸入Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行交集，得到藥物-疾病之間的共同靶點，繪制韋恩圖。

1.3 蛋白相互作用網絡構建 將篩選得到的疾病-藥物共同靶點導入STRING 10.5數據庫，構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡模型，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為>0.40，其他參數保持默認設置，獲得PPI網絡。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病全局網絡構建 采用Cytoscape(Version 3.7.1)軟件構建藥物-成分-靶點-疾病網絡，并將該網絡與得到的PPI網絡經Cytoscape的Merge功能合成全局性藥物-成分-靶點-疾病網絡。通過Cytoscape的附加功能CytoNCA計算網絡中節點的度中心性(degree centrality，DC)、中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)，這4個參數是網絡藥理學研究中評價網絡節點重要性的核心參數，值越大，說明節點越接近網絡的中心，越有可能是關鍵靶點。采用4個核心參數分析并篩選丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的核心靶點。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因及基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 應用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對藥物-疾病共同靶點進行GO富集分析以及KEGG通路富集分析，并采用Omicshare軟件繪制KEGG富集分析條狀圖。

2 結 果

2.1 丹皮-赤芍-黃連化學成分及靶點篩選 通過檢索TCMSP數據庫，以OB≥30%和DL≥0.18為條件，納入化學成分54個，有研究表明丹皮中丹皮酚(paeonol)含量較高且有明確的藥理作用[8]，故也納入候選成分，共得到化學成分55個，其中丹皮12個、赤芍29個、黃連14個，候選化學成分基本信息見表1。通過TCMSP數據庫檢索候選化學成分的靶點，共檢索到55個化學成分對應的533個作用靶點，其中丹皮對應的靶點有267個，赤芍對應的靶點有158個，黃連對應的點有161個，去重后共保留204個藥物靶點。應用STRING 10.5數據庫通過輸入靶點名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點校正為其官方名稱(official symbol)。

表1 候選化學成分基本信息

2.2 疾病相關靶點的收集及藥物-疾病共同靶點篩選 以“Tachyarrhythmia”為關鍵詞，檢索Gencards數據庫得到與疾病快速性心律失常相關的有治療作用的靶點共222個。將疾病靶點與藥物靶點輸入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖(見圖1)，并進行交集，得到藥物-疾病之間的共同靶點共16個，16個靶點信息詳見表2。

表2 藥物-疾病共同靶點

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡構建 將16個共同靶點導入STRING 10.5數據庫中，獲得PPI網絡圖，詳見圖2。圖中節點表示每個靶點，節點之間的直線代表靶點間有相互作用關系，每種顏色的線條分別代表不同關系，線條越多代表作用關系越強。

圖2 藥物-疾病共同靶點PPI網絡

2.4 藥物-成分-靶點-疾病全局網絡構建 采用Cytoscape 3.7.1軟件構建藥物-成分-靶點-疾病網絡，可得到網絡A，采用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網絡進行轉化，可得到網絡圖B，利用Cytoscape軟件中的Merge功能，將網絡A和網絡B進行合并，得到藥物-成分-靶點-疾病全局網絡C，詳見圖3。網絡中節點代表藥物、成分、靶點、疾病，邊代表藥物-成分-靶點-疾病之間的相互作用。采用CytoNCA計算網絡節點的 DC、BC、CC和EC值，靶點網絡拓撲學參數見表3，得到網絡中靶點DC中位數為13.5，度值大于中位數的靶點有NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6、ADRA1B、GJA1、TGFB1，說明這些靶點可能是丹皮-赤芍-黃連干預快速性心律失常的核心靶點。由圖3可知，與16個共同靶點有相互作用關系的藥物成分共有14個，這些成分可能為丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的關鍵成分，詳見表4。其中丹皮中有3個，分別為quercetin、kaempferol、paeonol；赤芍中有3個，分別為beta-sitosterol、paeoniflorin、Stigmasterol；黃連中有8個，分別為(R)-Canadine、coptisine、Berlambine、berberine、epiberberine、Worenine、palmatine、berberrubine。

表3 全局網絡靶點拓撲學參數

表4 與共同靶點有相互作用關系的藥物成分

圖3 藥物-成分-靶點-疾病全局網絡

2.5 GO功能富集分析 利用DAVID數據庫對16個藥物-疾病共同靶點進行GO富集分析，根據P<0.05，共收集到48個生物過程(BP)、10個細胞組分(CC)、8個分子功能(MF)，詳見表5～表7。生物過程主要涉及心室肌細胞膜復極的調節、腺苷酸環化酶激活、腎上腺素能受體信號通路、鈉離子輸運的調節、細胞信號轉導、肽基絲氨酸磷酸化的正調控、MAPK級聯的正調控、蛋白激酶B信號傳導的正調控、去甲腎上腺素對血管舒張的調節作用、心室肌細胞膜去極化的調節、基因表達的負調控、心房肌細胞膜去極化的調控、心房心肌細胞動作電位等。細胞組分主要涉及質膜、突觸后膜、軸突、細胞外基質、軸突終末、側質膜等。分子功能主要涉及支架蛋白結合、蛋白質結合、酶結合、去甲腎上腺素結合、腎上腺素結合、乙酰膽堿結合、蛋白質均聚活性、離子通道活性等。

表5 GO富集-生物過程

表6 GO富集-細胞組分

表7 GO富集-分子功能

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID數據庫對16個藥物-疾病共同靶點進行KEGG通路富集分析，根據P<0.05，共收集到13條信號通路，詳見表8。以P-adjust值進行排序，并繪制柱狀圖，詳見圖4。其中與快速性心律失常相關度較高的通路有3條，分別為cGMP-PKG信號通路(NOS3/ADRB2/ADRB1/ADRA1B/OPRD1)、心肌細胞腎上腺素能信號轉導通路(SCN5A/ADRB2/ADRB1/ADRA1B)、鈣信號通路(NOS3/ADRB2/ADRB1/CHRM3/ADRA1B)。

表8 KEGG通路富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

3 討 論

中醫理論建立在系統醫學方法論基礎上， 單一的成分或作用靶點研究難以充分揭示中藥復方的作用機制，而基于生物信息學基礎，運用網絡藥理學挖掘中藥復方治療疾病的物質基礎和分子機制，超越了單靶點思想的束縛，從多靶點的研究策略出發，通過構建網絡闡述復方多成分、多靶點、多作用機制的特點，從整體角度評價復方作用機制，其理念與中醫學的整體觀基本一致[9]。本研究基于網絡藥理學對丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質成分、潛在靶點及可能信號通路進行了初步探尋。藥物-成分-靶點-疾病全局網絡分析結果顯示，丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的關鍵成分共有14個，黃連中有8個，丹皮、赤芍各有3個。根據現有文獻報道，其中具有較明確抗快速性心律失常作用的成分有4個，分別為丹皮酚(丹皮)、槲皮素(丹皮)、芍藥苷(赤芍)、小檗堿(黃連)。丹皮酚可阻斷SD大鼠心肌細胞的鈣通道，減少鈣離子內流，降低心肌興奮性，進而抑制烏頭堿誘發的大鼠心律失常[10]；槲皮素能延長氯化鈣誘發大鼠心律失常出現的時間，縮短心律失常持續時間，減少心律失常發生率及死亡率[11]；芍藥苷可能通過阻斷L型鈣電流(ICa，L)，內向整流鉀電流和鈉電流，降低心室復極離散度，防止折返的形成，發揮抗心律失常作用[12]；歐陽松等[13]研究表明，小檗堿可能通過抑制延遲整流鉀電流、乙酰膽堿調節的鉀電流，延長心房肌場電位時程(fAPD)，加快興奮傳導速度(ECV)，延長心房肌細胞的動作電位時程(APD)及有效不應期(ERP)，從而發揮抗心房顫動作用。

藥物-成分-靶點-疾病全局網絡拓撲分析結果顯示，NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6、ADRA1B、GJA1、TGFB1等為丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的潛在靶點。根據現有研究報道，提示與快速性心律失常關系較密切的靶點有5個，分別為NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6。NOS3信號傳導通過調節L型Ca2+通道，降低鈣電流(ICa)抑制β腎上腺素能受體反應，縮短APD，從而起到抗心律失常作用[14]。KCNH2編碼的電壓門控鉀通道的α亞基，該通道介導心臟中延遲整流鉀電流的快速激活成分(IKr)，是心肌細胞動作電位3期快速復極的主要電流，KCNH2基因突變與長QT依賴的扭轉型室性心動過速(TdP)和心室纖顫(VF)相關[15]。SCN5A基因編碼NAv1.5通道蛋白，該蛋白作為心臟電壓門控鈉離子通道的成孔α亞基，對于心房和心室動作電位的啟動和傳播至關重要[16]，SCN5A功能獲得性突變不僅降低電流密度，也呈現出持續的晩鈉電流，持續的晩鈉電流擾亂心房肌細胞復極化，延長動作電位，從而誘發包括心房顫動及室性心律失常等[17]。ADRB2基因編碼β2腎上腺素能受體，該受體在蒲肯野纖維和竇房結有較高的分布，主要作用是通過影響鉀、鈣離子通道電流參與心律調節[18]。炎癥在心房顫動的發生和進展過程中扮演了重要角色，炎性因子IL6參與了心房顫動的發生和發展過程，炎性因子的水平變化與心房顫動預后相關[19]。

GO功能富集顯示，丹皮-赤芍-黃連對快速性心律失常作用靶點包含48個生物過程、10個細胞組分、8個分子功能。主要體現在心肌細胞膜去極、復極的調節，細胞信號轉導，離子通道活性，受體結合等方面。KEGG通路富集分析結果中與快速性心律失常相關的通路有3條，分別為cGMP-PKG信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉導通路、鈣信號通路等。其中，cGMP-PKG信號通路中cGMP是第二使者，介導一氧化氮(NO)的作用，其主要效應子之一是cGMP依賴性蛋白激酶(PKG)，其催化包括CaV1.2等離子通道在內的多種蛋白質磷酸化，導致蛋白活性或功能發生變化，而離子通道的活性和功能變化與心律失常的發生密切相關[20]。心肌細胞腎上腺素能信號轉導通路主要涉及α和β腎上腺素能受體，通過α和β受體影響ICa，L、IKr、延遲整流鉀電流的慢成分(IKs)、內向整流鉀電流(IK1)等電流，影響心室肌復極化過程，從而影響心律失常的發生與發展，其中α受體主要的調節途徑包括通過G蛋白偶聯磷脂酶C(PLC)調節細胞膜磷酯(PIP2)代謝導致的抑制作用，影響最明顯的是對KCNQ1、hERG和Kir2通道，分別導致IKs、IKr、IK1電流抑制；β受體在心室肌上主要為β1亞型占絕對優勢，并由cAMP-PKA磷酸化途徑介導了ICa，L和IKs電流增強效應[21]。鈣信號通路受β腎上腺素及α1腎上腺素的調節，β腎上腺素能受體激活后能通過激活電壓門控型鈣通道和受體門控型鈣通道的開放，促進胞外Ca2+內流，而α1腎上腺素能受體可以激活PLC介導的細胞內信號轉導，水解磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，生成二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，IP3與內質網上的IP3配體門鈣通道結合，開啟鈣通道，使胞內Ca2+濃度升高，激活包括鈣調蛋白(CaM)在內的各類依賴鈣離子的蛋白，調節肌漿網對Ca2+釋放，進而調節細胞內的Ca2+濃度，當CaM表達異常時易出現心肌細胞內鈣超載，引起瞬時內向電流導致延遲后除極，是自律性心律失常的重要發病機制[22-23]。

本研究提示槲皮素、丹皮酚、芍藥苷、小檗堿等可能為丹皮、赤芍、黃連發揮作用的關鍵成分，其通過作用于NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6等靶點，影響多種離子通道活性和心肌細胞膜的去極、復極以及cGMP-PKG信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉導通路和鈣信號通路，從而發揮抗心律失常作用。本研究初步揭示了丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的可能成分、潛在靶點以及信號通路，為后續進一步開展涼血清熱藥組丹皮-赤芍-黃連治療快速性心律失常的物質基礎及作用機制相關研究提供了新的思路。