紅景天甙調(diào)控sirt1/FOXO1通路改善酒精性肝損傷的實驗研究

孫書林,吳發(fā)明,金錦蓮

(國藥葛洲壩中心醫(yī)院,湖北 宜昌443000)

酒精性肝損傷(Alcoholic liver injury，ALI)指長期大量飲酒或短時間內(nèi)攝入大量酒精而引起的肝臟疾病[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent Information Regulator 1，sirt1)/叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead transcription factor，F(xiàn)OXO1)通路可調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂代謝等病理過程，并參與ALI疾病發(fā)生[2]。故探究sirt1/FOXO1通路的調(diào)控作用，可能對闡明ALI病理機制具有一定臨床意義。中藥提取物紅景天甙可抗肝纖維化具有保肝作用，且近來研究發(fā)現(xiàn)其可減輕ALI[3]。但紅景天甙改善ALI具體分子生物學(xué)機制不甚明確。本研究推測紅景天甙可能通過調(diào)控sirt1/FOXO1信號軸，改善酒精所致肝損傷，通過建立ALI大鼠模型，設(shè)置sirt1/FOXO1通路抑制劑對此進行驗證，以期闡明ALI病理機制及紅景天甙改善ALI分子生物學(xué)機制，為中藥的推廣及臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 大鼠ALI模型建立及分組給藥

清潔級SD雄性大鼠，7-8周齡，體重200-220 g，50只，用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、ALI模型組、紅景天甙(40 mg/kg)組、sirt1抑制劑(Tenovin-6)組(25 mg/kg)、紅景天甙+sirt1抑制劑(紅景天甙+Tenovin-6)組(40 mg/kg+25 mg/kg)，每組10只；除正常對照組大鼠灌胃給予生理鹽水外，其余各組大鼠均參照文獻[3]處理。各組大鼠均于造模同時進行干預(yù)治療，即每天13:00開始給藥，紅景天甙組、Tenovin-6組及紅景天甙+Tenovin-6組參照文獻[3-4]設(shè)置劑量并按10 mL/kg劑量灌胃給藥；正常對照組和模型組在相同時間按10 mL/kg的劑量灌胃給予生理鹽水。于第4周末次給藥后12 h取材進行后續(xù)試驗。

1.2 檢測方法

1.2.1大鼠一般行為觀察

各組大鼠均于給藥期間觀察大鼠的精神狀態(tài)及體質(zhì)量等一般情況。

1.2.2大鼠肝功能指標(biāo)檢測及組織標(biāo)本采集

取腹主動脈血，離心分離后取血清，檢測血清甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平；置于-80℃冰箱保存，剩余肝組織置于4%多聚甲醛中備用。

1.2.3大鼠肝組織HE染色

取1.2.2項下4%多聚甲醛溶液中的肝組織，按HE試劑盒說明書操作，并在顯微鏡下觀察肝組織變化。

1.2.4大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA含量

取1.2.2項下-80℃保存的肝組織，解凍后用組織勻漿器勻漿、離心分離，按SOD、MDA試劑盒說明書中操作方法對肝組織中SOD、MDA水平進行檢測。

1.2.5Western blot法檢測肝組織sirt1、FOXO1、acFOXO1、AdipoR2、MTP蛋白相對表達水平

取1.2.2中-80℃保存的肝組織，解凍后用組織勻漿器(10%蛋白裂解液)勻漿、離心(12 000 rpm，4℃，15 min)分離，取上清液0.5 mL，用BCA法對蛋白總濃度進行檢測后，取20 μg蛋白進行電泳(SDS-PAGE)分離及轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)、封閉(5%脫脂牛奶封閉1 h)后，加入一抗抗體(sirt1、FOXO1、acFOXO1、AdipoR2、MTP、β-actin(內(nèi)參))抗體，稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000)，在4℃條件下孵育過夜，次日用TBST洗滌并加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)，37℃條件下孵育1 h后，TBST洗滌3-4次后，采用增強化學(xué)發(fā)光法(滴加ECL發(fā)光液)顯色，以化學(xué)發(fā)光儀拍照并觀察條帶灰度，以Image-J軟件分析系統(tǒng)分析各組蛋白灰度值并進行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為觀察變化

正常對照組大鼠在造模過程和給藥期間，飲食規(guī)律，皮毛色澤光亮，精神狀態(tài)較好；模型組大鼠乙醇灌胃后出現(xiàn)精神興奮、亢進，2 h后出現(xiàn)精神萎靡，2周后大鼠出現(xiàn)皮毛色澤變暗干枯、精神狀態(tài)差、飲食減少、體重下降現(xiàn)象；紅景天甙組大鼠一般情況均優(yōu)于模型組；紅景天甙+Tenovin-6組大鼠一般情況較紅景天苷組差。

2.2 紅景天甙組對大鼠肝功能指標(biāo)TG、ALT、AST水平的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠肝功能指標(biāo)血清TG、ALT、AST水平升高；與模型組相比，紅景天甙組大鼠肝功能指標(biāo)呈降低趨勢，Tenovin-6組呈升高趨勢；紅景天甙+Tenovin-6組趨勢變化與紅景天苷組相反(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TG、ALT、AST水平比較

2.3 紅景天苷對大鼠肝組織病理損傷的影響

正常對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠肝組織可見肝細(xì)胞水腫壞死、胞漿內(nèi)脂肪空泡變性、及炎性細(xì)胞浸潤及肝小葉內(nèi)纖維化等病理損傷；與模型組相比，紅景天甙組大鼠上述病理損傷減輕；Tenovin-6組病變加重。紅景天甙+Tenovin-6組病變程度介于Tenovin-6組和紅景天甙組之間，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色圖(200×)

2.4 紅景天苷對大鼠肝組織SOD、MDA水平的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織MDA升高，SOD降低，氧化應(yīng)激水平趨勢升高；與模型組相比，紅景天甙組肝組織氧化應(yīng)激水平呈降低趨勢；Tenovin-6組呈升高趨勢；紅景天甙+Tenovin-6組趨勢變化與紅景天苷組相反(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肝組織SOD、MDA含量比較

2.5 紅景天苷對大鼠肝組織sirt1、FOXO1、acFOXO1、AdipoR2、MTP蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織sirt1、AdipoR2、MTP蛋白表達呈降低趨勢，acFOXO1/FOXO1呈升高趨勢；Tenovin-6組sirt1、AdipoR2、MTP變化趨勢進一步降低，acFOXO1/FOXO1進一步升高；紅景天甙組上述變化趨勢與模型組相反；紅景天甙+Tenovin-6組變化趨勢與紅景天苷組相反(P<0.05)。見圖2。

圖2 紅景天苷對大鼠肝組織蛋白表達的影響

3 討論

近年來，ALI患病率逐漸升高且已成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝病。乙醇在肝細(xì)胞微粒體代謝過程中產(chǎn)生的大量乙醛，是導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)及病理損傷的主要原因之一[5]。另外，當(dāng)過量酒精刺激肝臟細(xì)胞，引起肝臟氧化應(yīng)激損傷時，肝細(xì)胞胞漿及線粒體中轉(zhuǎn)氨酶ALT及AST顯著升高并釋放到血液中，血清TG含量明顯升高[6]。中藥提取物紅景天甙具有抗疲勞、抗衰老、抗缺氧、抗肝纖維化等多種藥理作用[7]，且紅景天甙能夠通過減輕肝組織炎癥、增加抗氧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化，改善大鼠酒精性肝損傷病理變化[4]。本研究結(jié)果證實紅景天甙具有改善ALI大鼠肝功能作用，然而具體分子生物學(xué)機制不甚明確，本研究對此進行探究，以期為紅景天甙的開發(fā)應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

乙醇代謝可致氧化型輔酶I與還原型輔酶I比例降低，進而抑制sirt1生物活性，加重肝臟損傷。sirt1通過調(diào)節(jié)FOXO1去乙酰化水平，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥、自噬及凋亡等多種生理過程，還可與AdipoR2啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抵抗氧化應(yīng)激，減少肝臟脂質(zhì)沉積并阻止脂肪肝發(fā)生。MTP為重要的脂質(zhì)蛋白，可與載脂蛋白結(jié)合，將含脂蛋白以低密度脂蛋白-甘油三酯的形式轉(zhuǎn)運出肝臟[8]，而FOXO1可直接刺激MTP活性，參與脂質(zhì)代謝過程。本研究推測乙醇可抑制sirt1活性，抑制FOXO1去乙酰化水平，使得肝組織中acFOXO1較高，進而引起下游調(diào)節(jié)蛋白AdipoR2、MTP表達降低，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂和脂質(zhì)堆積，可能是ALI病理損傷的機制之一。結(jié)果提示紅景天甙可能通過激活sirt1表達，抑制FOXO1乙酰化水平，激活FOXO1去乙酰化水平，降低肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和脂質(zhì)堆積。為了驗證這一推測，本研究設(shè)置sirt1通路抑制劑Tenovin-6進行驗證，表明Tenovin-6可逆轉(zhuǎn)紅景天甙改善ALI大鼠肝臟損傷的作用。

綜上所述，紅景天甙可通過激活sirt1/FOXO1/AdipoR2/MTP通路，改善肝臟脂質(zhì)代謝，減輕脂質(zhì)堆積，保護ALI大鼠肝功能，可能為闡明紅景天甙在改善ALI進程中作用提供一定參考，但sirt1/FOXO1通路下游靶分子較多，紅景天甙也可能通過sirt1/FOXO1通路調(diào)控炎癥和自噬來緩解ALI，這需要后續(xù)繼續(xù)深入研究。