ctDNA對肝細(xì)胞肝癌患者根治性肝切除術(shù)后短期復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

陳延華，鄧凱文

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）大約占原發(fā)性肝癌的85%～90%，具有極高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，患者整體預(yù)后較差［1］。根治性肝切除術(shù)（pancreatico－duodenectomy，PD）是HCC治療的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，尤其是2年內(nèi)的早期復(fù)發(fā)對治療效果造成嚴(yán)重影響，可直接縮短患者術(shù)后長期生存時間［2，3］。血漿循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是一種攜帶腫瘤特異性基因組改變的腫瘤標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的研究［4］。該研究通過分析ctDNA對HCC患者根治性肝切除術(shù)后短期復(fù)發(fā)的預(yù)測價值，旨在為術(shù)后肝癌患者篩查、診斷、治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月—2019年1月行根治性肝切除術(shù)的208例HCC患者的臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）接受根治性肝切除術(shù)治療；（2）術(shù)前未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）心、肺、腎功能良好，能夠耐受手術(shù)；（4）術(shù)后病理確診為HCC；（5）肉眼所見腫瘤被完整切除，且切緣無殘余癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無法耐受手術(shù)；（2）手術(shù)前進(jìn)行其他抗癌治療；（3）圍手術(shù)期死亡。208例HCC患者中，男162例，女46例；年齡20～78歲，平均（53.91±8.24）歲。選取正常人群85例作為對照，男59例，女26例；年齡22～79歲，平均（54.12±8.37）歲。2組性別、年齡等資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法術(shù)后抽取患者肘靜脈血10 ml用以檢測ctDNA表達(dá)，具體步驟如下：（1）離心分離血漿備用；（2）采用DNA抽提試劑盒提取ctDNA，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行；（3）使用試劑盒將打斷后的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建，PCR擴增文庫；（4）測序獲取全基因組長度；（5）Blast比對，進(jìn)行CNVs分析，計算ctDNA含量，以健康人群ctDNA百分含量做參照，設(shè)定以ctDNA含量＜0.1%為陰性，ctDNA含量≥0.1%為陽性。

1.3 隨訪患者手術(shù)出院后采用門診隨訪進(jìn)行觀察，隨訪截止至2019年2月或患者死亡，檢查患者肝功能、CT明確患者腫瘤是否復(fù)發(fā)以及發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移，具體方案為：術(shù)后3個月，每月來院復(fù)查1次，術(shù)后6個月，每3個月來院復(fù)查1次，術(shù)后1年，每6個月復(fù)查1次。

1.4 觀察指標(biāo)（1）比較ctDNA在肝癌組和對照組中的表達(dá)差異，根據(jù)隨訪結(jié)果將肝癌組患者分為復(fù)發(fā)組（肝內(nèi)復(fù)發(fā)、肝外轉(zhuǎn)移）和非復(fù)發(fā)組，其中復(fù)發(fā)組患者復(fù)發(fā)時間≤6個月納入短期復(fù)發(fā)組，復(fù)發(fā)時間＞6個月納入非短期復(fù)發(fā)組；（2）比較不同組別肝癌組織中ctDNA陽性表達(dá)率的差異；（3）分析患者性別分布、年齡、肝功能Child分級、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、血清肝炎病毒標(biāo)志物、門靜脈癌栓、包膜完整、分化程度以及ctDNA表達(dá)與HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以［n（%）］表示，行χ2檢驗；ctDNA表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系比較采用χ2檢驗，將所有可能的危險因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析；生存情況應(yīng)用Kaplan－Meier生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果術(shù)后對208例HCC患者進(jìn)行隨訪5～86個月，中位隨訪時間39個月，至隨訪終止，133例患者確診為HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（復(fù)發(fā)組），占63.94%，其中短期復(fù)發(fā)（短期復(fù)發(fā)組）占30.83%（41/133），非短期復(fù)發(fā)（非短期復(fù)發(fā)組）占69.17%（92/133），75例無復(fù)發(fā)（非復(fù)發(fā)組），占36.06%。短期復(fù)發(fā)組中肝外轉(zhuǎn)移占36.59%（15/41），高于非短期復(fù)發(fā)組的15.12%（14/92），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.595，P=0.006）。隨訪終止時死亡102例，死因與HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)占93.14%（95/102），與肝病相關(guān)占4.90%（5/102），其他因素占1.96%（2/102），短期復(fù)發(fā)組病死率為90.24%（37/41），高于非短期復(fù)發(fā)組的66.30%（61/92），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.382，P=0.004）。

2.2 ctDNA在HCC中的表達(dá)情況肝癌組ctDNA陽性表達(dá)151例，占72.60%（151/208），對照組均不表達(dá)ctDNA，2組陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=127.325，P＜0.001）。復(fù)發(fā)組陽性表達(dá)99例，占74.44%（99/133），非復(fù)發(fā)組陽性表達(dá)52例，占69.33%（52/75），2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.628，P=0.428）。短期復(fù)發(fā)組陽性表達(dá)率為87.80%（36/41），高于非短期復(fù)發(fā)組的68.48%（63/92），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.567，P=0.018）。

2.3 HCC患者術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)與臨床病理特征比較腫瘤直徑＞5 cm、腫瘤數(shù)目多個、門靜脈有癌栓、包膜不完整、低中分化以及ctDNA表達(dá)陽性患者術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)率明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)與臨床病理特征比較

續(xù)表1

2.4 影響HCC患者術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析以根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)為因變量（1=復(fù)發(fā)，0=無復(fù)發(fā)），將單因素分析中可能的危險因素（腫瘤直徑＞5 cm、腫瘤數(shù)目多個、門靜脈有癌栓、包膜不完整、低中分化以及ctDNA表達(dá)陽性）全部納入作為自變量，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑＞5 cm、門靜脈有癌栓、低中分化以及ctDNA表達(dá)陽性是影響根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 影響HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析

2.5 ctDNA表達(dá)與術(shù)后短期復(fù)發(fā)HCC患者生存情況關(guān)系Kaplan－Meier生存分析結(jié)果顯示，ctDNA陽性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者生存時間為3.71個月（95%CI：3.30，4.12），ctDNA陰性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者生存時間為5.64個月（95%CI：5.44，5.85），ctDNA陽性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者生存時間與ctDNA陰性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log－rankχ2=7.622，P=0.006）。見圖1。

圖1見封三。

圖1 ctDNA表達(dá)與根治性肝切除術(shù)后短期復(fù)發(fā)HCC患者生存情況關(guān)系

3 討論

HCC是全球癌癥死亡的主要原因，多數(shù)患者確診時已處于晚期肝纖維化和肝硬化狀態(tài)，盡管根治性肝切除術(shù)可取得良好的治愈效果，但患者預(yù)后仍然較差，術(shù)后患者早期復(fù)發(fā)率較高，長期生存時間不盡滿意［5－8］。因此、早期診斷、治療、療效預(yù)測以及改善患者預(yù)后，對延長患者長期生存時間、提高整體生活質(zhì)量有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，檢測血液中ctDNA在腫瘤診斷、治療以及預(yù)后評估等方面發(fā)揮重要作用［9］。利用ctDNA篩選基因突變具有較高的敏感性和特異性，ctDNA分析可準(zhǔn)確判斷腫瘤進(jìn)展、預(yù)后以及輔助靶向治療［10］。Olsson等［11］研究顯示，ctDNA是原發(fā)性乳腺癌預(yù)后不良的預(yù)測因素，對ctDNA進(jìn)行監(jiān)測可以預(yù)測幾個月到幾年的臨床轉(zhuǎn)移，檢測ctDNA在原發(fā)性乳腺癌中具有較好的應(yīng)用前景。Chaudhuri等［12］報道指出，ctDNA是早期發(fā)現(xiàn)局限性肺癌術(shù)后殘留病灶的生物標(biāo)志物，能夠可靠地鑒別復(fù)發(fā)的高危患者，有利于指導(dǎo)臨床制定治療策略。Xu等［13］報道認(rèn)為，HCC腫瘤DNA與匹配的血漿ctDNA甲基化標(biāo)志物高度相關(guān)，可有效預(yù)測患者預(yù)后和生存率預(yù)后。

該研究結(jié)果顯示，短期復(fù)發(fā)患者占全部復(fù)發(fā)患者的30.83%，但90.24%患者在隨訪期內(nèi)死亡，表明6個月作為短期復(fù)發(fā)時間可較早反映患者預(yù)后情況。該研究結(jié)果還顯示，對照組患者均未檢測出ctDNA表達(dá)，短期復(fù)發(fā)組ctDNA陽性表達(dá)率87.80%明顯高于非短期復(fù)發(fā)組的68.48%，且HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)率與患者腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、門靜脈癌栓、包膜完整、分化程度以及ctDNA表達(dá)明顯相關(guān)，表明ctDNA預(yù)測疾病復(fù)發(fā)具有較高的特異性、敏感性，可能與HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)有關(guān)。進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者腫瘤直徑＞5 cm、門靜脈有癌栓、低中分化以及ctDNA表達(dá)陽性是影響根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的獨立危險因素，表明ctDNA表達(dá)陽性患者具有更高的腫瘤復(fù)發(fā)率，可作為預(yù)測HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。通過Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，ctDNA陽性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者生存時間為3.71個月（95%CI：3.30，4.12），ctDNA陰性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者生存時間為5.64個月（95%CI：5.44，5.85），ctDNA陽性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者生存時間明顯短于ctDNA陰性表達(dá)組短期復(fù)發(fā)HCC患者，進(jìn)一步表明ctDNA表達(dá)陽性短期復(fù)發(fā)HCC患者生存預(yù)后更差，檢測ctDNA表達(dá)可作為術(shù)后輔助治療的依據(jù)。檢測ctDNA表達(dá)可實時追蹤腫瘤進(jìn)展，有效識別患者體內(nèi)微小殘留病灶以及疾病休眠，因此，ctDNA可作為HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的重要預(yù)測指標(biāo)［14，15］。總之，ctDNA在HCC中具有良好的應(yīng)用前景，檢測術(shù)后患者ctDNA表達(dá)以及研究其與預(yù)后的關(guān)系，值得更多學(xué)者深入探究，ctDNA作為精準(zhǔn)、無創(chuàng)的檢測手段，或可在HCC各個臨床階段發(fā)揮作用。

綜上所述，肝癌組織中ctDNA陽性表達(dá)率明顯升高，ctDNA是預(yù)測HCC患者根治性肝切除術(shù)后腫瘤短期復(fù)發(fā)的獨立危險因素，ctDNA陽性表達(dá)短期復(fù)發(fā)患者生存時間明顯短于ctDNA陰性表達(dá)患者，根治性肝切除術(shù)后對ctDNA進(jìn)行監(jiān)測有助于早期鑒別高危患者，進(jìn)而予以個性化治療以延長患者生存時間，改善患者生活質(zhì)量，提高治愈率。但該研究所收集樣本例數(shù)受限，所得到的結(jié)論有待進(jìn)行深入研究佐證。