基于系統(tǒng)藥理學(xué)菊花清熱解毒功效的分子機(jī)制研究

王春花，曲雪嘉，孔令鈺，孫雪芳

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000）

菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRa-mat.）的干燥頭狀花序，屬于藥食同源類中藥，其藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬上品，歸肺、肝經(jīng)，久服輕身耐老延年，具有清熱解毒、平肝明目等功效，在臨床上常被用于治療風(fēng)熱感冒、目赤腫痛、瘡癰腫毒等癥［1，2］。在日常生活中，老百姓也常茶飲菊花或配伍其他中藥達(dá)到清熱解毒、防治疾病的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菊花具有抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛等作用，其清熱解毒功效與菊花抗炎藥理活性有一定的相關(guān)性［3］。目前，有關(guān)菊花的研究多集中在單一化學(xué)成分及其藥理作用的解析，中醫(yī)理論指導(dǎo)下的清熱解毒功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制方面的研究相對(duì)匱乏［3-5］。系統(tǒng)藥理學(xué)是從多成分-多靶點(diǎn)相互聯(lián)系的角度在整體水平上研究中藥作用機(jī)制的一種新手段，通過識(shí)別藥效物質(zhì)、藥物靶點(diǎn)揭示疾病治療機(jī)制，從系統(tǒng)水平及整體水平研究和解決中藥藥效學(xué)和中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論等關(guān)鍵問題，其研究方法符合中藥治療疾病的核心思想。近年來，在探索和預(yù)測(cè)中醫(yī)藥治療不同疾病的分子機(jī)制方面做出了顯著貢獻(xiàn)［6-8］。本研究采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法，探討了菊花清熱解毒功效的分子機(jī)制，為菊花清熱解毒功效的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菊花活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php）檢索并篩選菊花中符合口服利用度利用TCMSP、Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca）搜索化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白質(zhì)，合并作為化學(xué)成分的靶點(diǎn)。將化合物-靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建菊花化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點(diǎn)間的度（Degree）值，確定菊花關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2 菊花靶點(diǎn)GO富集及關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

將菊花靶點(diǎn)蛋白質(zhì)基因上傳在線數(shù)據(jù)庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov），物種限定為“Homospaiens”，設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行GO（Gene ontology）生物學(xué)過程富集分析。對(duì)菊花靶點(diǎn)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG（KEGG pathway analysis）代謝通路富集分析，并通過Cyto?scape 3.7.1軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，分析菊花清熱解毒功效的分子機(jī)制。

1.3 菊花靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將菊花相關(guān)靶點(diǎn)帶入在線網(wǎng)站STRING 11.0（https：//string-db.org），物種選擇為“Homo spaiens”，打分值設(shè)置＞0.9，獲取菊花化合物靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)信息，刪去無關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建菊花靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，分析菊花清熱解毒功效靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。

1.4 菊花靶點(diǎn)器官定位

通 過BIOGPS數(shù)據(jù)庫（http：//biogps.org/#goto=welcome）對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行器官定位分析，統(tǒng)計(jì)并整理各靶點(diǎn)組織分布信息，通過Cytoscape 3.7.1軟件繪制菊花核心靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用TCMSP平臺(tái)篩選并去除無靶點(diǎn)化合物后共獲得21種符合條件的活性成分。如圖1所示，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括276個(gè)節(jié)點(diǎn)（21種化合物、255個(gè)靶點(diǎn)）和561條邊，菊花化合物由紅色節(jié)點(diǎn)代表，節(jié)點(diǎn)大小與Degree值相關(guān)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，內(nèi)圈藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為連接化合物大于10個(gè)的靶點(diǎn)，該網(wǎng)絡(luò)說明菊花清熱解毒功效可能是多成分、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果。在菊花化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)化合物有平均靶點(diǎn)數(shù)目26.7個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與12.1個(gè)化合物相互作用，Degree值排名前5的成分是槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteo?lin）、柚皮素（Naringenin）、β-谷甾醇（Beta-sitoster?ol），靶點(diǎn)≥10的化合物為菊花關(guān)鍵成分（表1）。從靶點(diǎn)的角度來看，連接化合物≥10個(gè)的靶點(diǎn)有6個(gè)，分別為前列腺素G/H合酶2（Prostaglandin G/H syn?thase 2）、核受體輔活化子2（Nuclear receptor coacti?vator 2）、前列腺素G/H合酶1（Prostaglandin G/H syn?thase 1）、熱 休 克 蛋 白90（Heat shock protein HSP 90）、二肽基肽酶IV（Dipeptidyl peptidase IV）、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α（PKA Catalytic Sub?unit C-alpha），連接化合物≥10個(gè)的靶點(diǎn)為菊花關(guān)鍵靶點(diǎn)（表2）。化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)如圖2所示，菊花關(guān)鍵靶點(diǎn)主要與壞死（Necrosis）、產(chǎn)前暴露遲發(fā)效應(yīng)（Prenatal exposure delayed effects）、化學(xué)藥物性肝損傷（Chemical and drug induced liver injury）、炎癥（Inflammation）、減重（Weight loss）、細(xì)胞增生（Hyperplasia）、腎臟疾病（Kidney diseases）和水腫（Edema）相關(guān)，推測(cè)菊花的清熱解毒功效可能與大部分活性成分發(fā)揮調(diào)控炎癥、壞死過程有關(guān)。

圖1 菊花化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 菊花度值≥10的活性化合物基本信息

表2 菊花度值≥10的靶點(diǎn)基本信息

2.2 靶點(diǎn)通路分析

圖2 菊花化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

通過DAVID數(shù)據(jù)庫中GO功能富集分析得到GO條目146個(gè)（P＜0.05），其中生物過程（BP）條目105個(gè)，占72%，分子功能（CC）條目17個(gè)，占12%，細(xì)胞組成（MF）相關(guān)條目24個(gè)，占16%，主要GO條目如圖3所示。KEGG通路注釋分析，按P值排列前15條生物通路結(jié)果如圖4所示。其中包括癌癥信號(hào)通 路（Pathways in cancer、Bladder cancer、Pancreatc cancer、Prostate cancer、Non-small cell lung cancer）、炎癥信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、免疫相關(guān)信號(hào) 通 路（Influenza A、Hepatitis B、Toxoplasmosis、Leishmaniasis、HTLV-Iinfection），通路中出現(xiàn)次數(shù)≥10的靶點(diǎn)有12個(gè)，包括AKT1、TP53、CCND、TGFB1、CDKN1A、MAPK3、MAPK1、IKBKB、NFKBIA、CHUK、RAF1、BAD，這些靶點(diǎn)蛋白主要參與細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫和應(yīng)激應(yīng)答等過程。結(jié)果表明，菊花清熱解毒的功效與調(diào)控這些信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

圖3 菊花靶點(diǎn)GO富集

圖4 菊花靶點(diǎn)KEGG通路

2.3 菊花靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了更好地理解菊花清熱解毒功效的作用機(jī)制，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了菊花PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，PPI網(wǎng)絡(luò)包括244個(gè)節(jié)點(diǎn)，946條相互關(guān)系，去掉無相互關(guān)系的35個(gè)節(jié)點(diǎn)，其余209個(gè)節(jié)點(diǎn)利用Cytoscape 3.7.1軟件繪制菊花靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)如圖5所示。節(jié)點(diǎn)Degree值≥10的節(jié)點(diǎn)共72個(gè)，為菊花的核心靶點(diǎn)，其中JUN、TP53、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、HSP90AA1、IL6等出現(xiàn)頻率較高，根據(jù)Degree值大小繪制Degree值≥20的核心蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖（圖6）。核心靶點(diǎn)中共包含11個(gè)炎癥相關(guān)靶點(diǎn)（TNF、IL1B、IL6、NOS2、CCL2、CXCL8、IL10、AKT1、VEGFA、MMP9、CXCL2），這些靶點(diǎn)蛋白在菊花清熱解毒功效中起到關(guān)鍵作用。

圖5 菊花靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶點(diǎn)定位分析與歸經(jīng)理論的相關(guān)性分析

圖6 菊花核心靶點(diǎn)（Degree值≥20）

利用BIOGPS數(shù)據(jù)庫對(duì)主要靶點(diǎn)（Degree值≥20）定位分析，保留每個(gè)基因表達(dá)量最高的排在前5位的組織，利用Cytoscape軟件繪制靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)圖（圖7），圖中節(jié)點(diǎn)大小與Degree值一致。結(jié)果表明，這些靶點(diǎn)主要分布在肺（Lung，Degree值=6），平滑肌（Smooth muscle，Degree值=4），肝臟（Liver，De?gree值=3），扁桃體（Amygdala，Degree值=3），甲狀腺（Thyroid，Degree值=3），前列腺（Prostate，Degree值=3），該結(jié)果與菊花歸肺、肝經(jīng)一致，這些組織器官在菊花清熱解毒功效中發(fā)揮重要作用。此外，CD33+髓樣細(xì)胞（CD33+Myeloid，Degree值=9），伯基特淋巴瘤（Lymphoma burkitts，Degree值=6）、心肌細(xì)胞（Cardiacmyocytes，Degree值=5）（CD56+NK Cells，Degree值=4）BDCA4+樹突狀細(xì)胞（BDCA4+Dentrit?ic Cells，Degree值=4），CD14+單 核 細(xì) 胞（CD14+Monocytes，Degree值=4），721 B淋巴母細(xì)胞（721 B lymphoblasts，Degree值=4）等細(xì)胞發(fā)揮重要的作用。

圖7 菊花靶點(diǎn)-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

3 討論

利用系統(tǒng)藥理學(xué)分析了菊花清熱解毒功效的分子機(jī)制，以口服生物利用度（OB）與類藥性（DL）為指標(biāo)通過TCMSP與Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選出菊花中符合條件的化合物，建立備選化合物庫。結(jié)果表明，菊花主要通過槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物發(fā)揮清熱解毒作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菊花中作用最強(qiáng)的前5個(gè)化合物在抗炎、抗菌中起到不同程度的作用。槲皮素能明顯抑制大鼠急慢性前列腺炎模型與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型炎癥［9，10］，具有廣譜抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌均有明顯的抗菌效果［11］。山奈酚可通過MAPK等信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺炎［12］，抑制氣道炎癥［13］。木犀草素能夠降低炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性，抑制IL6等各類促炎因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，改善氣道炎癥［14］。β-谷甾醇可以抑制肺炎鏈球菌溶菌素對(duì)細(xì)胞侵染，通過抑制STAT1的產(chǎn)生及NF-κB的核轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗炎作用［15］。柚皮素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用［16，17］，可通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)釋放、iNOS活性等發(fā)揮抗炎作用［18，19］。通過化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)菊花關(guān)鍵靶點(diǎn)主要與炎癥、壞死等疾病相關(guān)，如菊花關(guān)鍵靶點(diǎn)前列腺素G/H合酶2為體溫調(diào)節(jié)介質(zhì)前列腺素合成的關(guān)鍵酶，可通過干預(yù)前列腺素E2的合成，參與機(jī)體發(fā)熱與炎癥等的調(diào)節(jié)［20］。以上分析說明，菊花的清熱解毒功效與其成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物等干預(yù)炎癥、壞死過程，發(fā)揮抗炎抗菌作用有關(guān)。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，菊花靶點(diǎn)主要作用于炎癥信號(hào)通路（TNF signaling pathway）和免疫相關(guān)信號(hào)通路（Influenza A、Hepatitis B、Toxoplasmosis、Leishmaniasis、HTLV-I infection），其中靶點(diǎn)AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1等在通路中出現(xiàn)次數(shù)較高，在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)為菊花作用的核心蛋白質(zhì)。AKT1與核心蛋白質(zhì)TNF、IL6、NOS2、MMP9均為炎癥相關(guān)靶點(diǎn)，是菊花抗炎發(fā)揮清熱解毒功效的重要靶蛋白。AKT1為致癌基因，是AKT家族的重要一員，在增殖、凋亡等細(xì)胞進(jìn)程及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［21，22］。菊花可能是通過抑制AKT磷酸化減少炎性因子IL6、TNFα的釋放，緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)。一氧化氮（NO）為重要的炎癥介質(zhì)［23］，菊花可能是通過作用于靶點(diǎn)NOS2，抑制NO的影響，張星海［3］證實(shí)菊花提取液干預(yù)炎癥小鼠后炎癥癥狀明顯改善，血清中NO顯著降低。菊花還可能是通過調(diào)控MMP9的表達(dá)，改善炎癥臨床表現(xiàn)發(fā)揮清熱解毒功效的抗炎機(jī)制［24］。通過靶點(diǎn)定位分析發(fā)現(xiàn)，菊花主要靶點(diǎn)分布于肺臟與肝臟，與菊花歸經(jīng)一致，這可能是菊花有效治療熱毒引起的目赤、風(fēng)熱證的原因之一。綜上所述，菊花清熱解毒的功效可能與槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物作用AKT1、TNF、IL6、NOS2、MMP9等核心靶點(diǎn)，調(diào)控炎癥和免疫相關(guān)信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，菊花清熱解毒的物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制的確定還需通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。