棗莊地區(qū)豌豆根瘤菌遺傳多樣性分析

黃宇寧 葛維德 張俊杰 楊 濤 劉 榮 尚益民李 冠 季一山 王晨瑜 李孟偉 嚴(yán) 昕 宗緒曉

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 北京100081；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所 沈陽110161；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南鄭州450002）

根瘤菌（Rhizobium）是一類與豆科植物共生的革蘭氏染色陰性細(xì)菌[1]，能夠誘發(fā)豆科植物根或莖上皮層細(xì)胞增生形成根瘤，還可以通過結(jié)瘤固定空氣中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為宿主植物生長所需的有機(jī)氮[2]。氮素作為植物生長發(fā)育必需的元素之一[3]，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過施工業(yè)氮肥來提高作物產(chǎn)量[4]。而長時(shí)間不恰當(dāng)?shù)厥褂霉I(yè)氮肥會(huì)造成土壤營養(yǎng)流失甚至嚴(yán)重破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，因此，生物固氮?jiǎng)t成為植物補(bǔ)充氮素的重要途徑。在生物固氮體系中60%以上的生物固氮量是通過根瘤菌—豆科植物共生體系完成的，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有非常重要的作用[5-6]。國內(nèi)對根瘤菌的很多研究技術(shù)都是鑒定和分類菌株，楊成運(yùn)等[7]對我國亞熱帶地區(qū)豌豆根瘤菌的研究發(fā)現(xiàn)，供試菌株的分類具有明顯的地域特征。李正等[8]對甘肅酒泉等地區(qū)的6株豌豆根瘤菌的研究發(fā)現(xiàn)，其具有很高的遺傳多樣性。Jiao等[9]在安徽和江西地區(qū)的豌豆根瘤中分離得到Rhizobium anhuiense。Li等[10]在山東半島海岸線上研究發(fā)現(xiàn)，Rhizobium anhuiense是海邊香豌豆的主要根瘤菌種群。

豌豆（Pisum sativum L.）是草本攀援性豆科植物，豌豆作為世界四大食用豆之一[11]，富含優(yōu)質(zhì)蛋白及人體所需的微量元素，在我國廣泛種植，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有重要地位的糧飼作物[12]。豌豆的生物固氮作用可以減少氮肥的使用、減少CO2的排放和提高土壤肥力，還可以與其他非豆科作物進(jìn)行輪作或套作來調(diào)整種植結(jié)構(gòu)[13]，使非豆科作物更好地吸收和利用土壤中氮素，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)高效及減少連作所導(dǎo)致病蟲害的發(fā)生[14-15]。因此，研究豌豆根瘤菌的遺傳多樣性篩選并接種合適的根瘤菌對提高豌豆產(chǎn)量具有重要意義。在本試驗(yàn)中，采集棗莊市山亭區(qū)豌豆種植基地土壤，通過土壤捕捉試驗(yàn)獲得豌豆根瘤[16]，對經(jīng)過分離純化的豌豆根瘤菌采用IGS-PCR RFLP分析、16SrRNA序列分析、持家基因和共生基因的系統(tǒng)發(fā)育分析等方法進(jìn)行分子鑒定。通過研究了解該地區(qū)豌豆根瘤菌遺傳多樣性及分類學(xué)地位，為今后豌豆根瘤菌優(yōu)良菌株的選取提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料來源 研究所用土壤采集于棗莊市山亭區(qū)豌豆種植基地，采集時(shí)間為2018年5月，豌豆種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國家作物種質(zhì)庫提供。

1.1.2 盆栽捕捉豌豆根瘤菌 將豌豆種子用無菌水清洗后用95%乙醇消毒30 s，倒掉95%乙醇后用0.2%的升汞溶液消毒5 min，消毒徹底的豌豆種子排放在水瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至種子完全萌發(fā)。將采集的土壤與加入植物低氮營養(yǎng)液且滅菌后的蛭石以1∶2的比例混合攪拌均勻，移入發(fā)芽種子后在人工氣候箱中培養(yǎng)45 d（光照時(shí)間為16 h/d,晝、夜溫度分別控制在28℃、20℃）。

1.1.3 根瘤菌的分離、純化與保藏 采集的粉紅色有效根瘤用0.2%的升汞溶液表面消毒后在YMA平板上用劃線法進(jìn)行分離純化[17]，得到的單菌落接種到Y(jié)MA斜面培養(yǎng)基，進(jìn)行臨時(shí)保存；同時(shí)將單菌落用TY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期后與50%的甘油以1∶1（體積比）混合均勻后長期保存在-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑和儀器

5×TBE、80%生理鹽水、95%乙醇、0.2%升汞溶液、無菌水、蒸餾水等。光照培養(yǎng)箱、28℃恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、恒溫水浴鍋、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、高速離心機(jī)、pH計(jì)、微波爐及冰箱等。

1.3 培養(yǎng)基和根瘤菌DNA提取

水瓊脂培養(yǎng)基：8 g瓊脂粉中加入1 000 mL去離子水。

YMA培養(yǎng)基：10 g甘露醇，3 g酵母粉，0.25 g KH2PO4，0.25 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g無水MgSO4加1 000 mL去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，最后加入15～18 g瓊脂粉。

TY培養(yǎng)基：3 g酵母粉，5 g胰蛋白胨，0.7 g CaCl·22H2O，加入1 000 mL去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2。

DNA的提取：首先將單菌落在TY培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后使用生工生物工程（上海）股份有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒（B518255-0050）進(jìn)行DNA提取，得到的DNA樣品檢測合格后置于-20℃冰箱中待用。

1.4 16S-23S rRNA的PCR-RFLP檢測分析

IGS（Intergenic Spacer）PCR擴(kuò)增的正反向引物為FGPS1490和FGPL132′，引物正反序列見表1[18]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)及反應(yīng)運(yùn)行程序參考文獻(xiàn)[18]中方法。將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進(jìn)行酶切反應(yīng)。選取的3種限制性內(nèi)切酶分別為HaeIII、HhaI和MspI。酶切反應(yīng)為10μL體系，其中包括16S-23S rRNA產(chǎn)物5μL、限制性內(nèi)切酶0.5μL、10×Buffer 1μL和ddH2O 3.5μL， 在37℃恒溫培養(yǎng)箱酶切8～10 h。酶切完成后經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將凝膠成像系統(tǒng)顯示的酶切條帶大小進(jìn)行分型處理。

表1 試驗(yàn)用的PCR引物

1.5 16S rRNA基因的序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

選取IGS酶切不同類型的代表菌株進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，正反向引物為P1和P6，引物正反序列見表1[18]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)及反應(yīng)運(yùn)行程序參考文獻(xiàn)[18]中方法。將合格的PCR產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列的拼接、GenBank數(shù)據(jù)庫和MEGA 7.0軟件中CLUSTAL W程序計(jì)算序列之間的遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 持家基因和共生基因PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

分別用持家基因（atpD、recA、glnII）和共生基因（nodC）對代表菌株進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，正反向引物分別為atpD 225F/782R、recA 41F/640R、glnII 12F/689R和nodC for540/rev1160，引物正反序列見表1[18]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)及反應(yīng)運(yùn)行程序參考文獻(xiàn)[18]中方法。代表菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，數(shù)據(jù)處理同“1.5”。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌分離、純化以及保藏

一共從根瘤中分離獲得55株菌，菌株在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，菌落直徑達(dá)到3～5 mm，這些單菌落呈圓形，不透明，表面光滑濕潤、有凸起，獲得的菌株臨時(shí)保藏于YMA培養(yǎng)基斜面。

2.2 16S-23S rRNA的PCR-RFLP檢測分析結(jié)果

經(jīng)過3種限制性內(nèi)切酶 （HaeIII、HhaI和MspI）酶切及酶切圖譜整合、歸類，最終把55株豌豆根瘤菌分為3種IGS類型（表2）。類型1包含12株根瘤菌，占總菌數(shù)的21.8%；類型2含22株，占總數(shù)的40.0%；類型3含21株，占總數(shù)的38.2%。類型2和類型3為主要圖譜類型，2種類型的總和占總菌數(shù)比例達(dá)78.2%。

2.3 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

根據(jù)IGS的酶切圖譜分型結(jié)果，從3種酶切類型中選取9個(gè)代表菌株，其中類型1有3株，分別是SD1、SD2-1、SD3-13，類型2有2株，分別是SD1-11和SD2-2，類型3有4株，分別是SD1-14、SD2-10、SD3-14、SD3-15。將這9個(gè)代表菌株進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增，檢測合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送到公司測序，得到的基因序列數(shù)據(jù)處理后經(jīng)過NCBI序列比對，選取具有較高序列相似性的參考序列和部分已知根瘤菌屬種群的序列，用Mega 7.0軟件進(jìn)行分析并基于NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。9個(gè)代表菌株與根瘤菌屬的代表菌株聚成1個(gè)進(jìn)化分支，由此判定棗莊市山亭區(qū)的豌豆根瘤菌屬于根瘤菌屬。對于這個(gè)進(jìn)化分支，9個(gè)代表菌株之間序列相似性為100%， 與Rhizobium acidisoli FH13T、Rhizobium anhuiense CCBAU 23252T等4株已知根瘤菌代表菌株序列相似性均為100%。參試9株豌豆根瘤菌的序列與剩余的已知根瘤菌屬種群的序列相似性均大于98.6%，且與外源群體的模式菌株Bradyrhizobium japonicum USDA 6T（大豆慢生根瘤菌）的相似性小于88.0%，最終，所有豌豆根瘤菌被鑒定屬于根瘤菌屬（Rhizobium）。

2.4 持家基因atpD、rec A、glnII多位點(diǎn)序列分析結(jié)果

將9個(gè)代表菌株進(jìn)行atpD、recA、glnII持家基因的PCR擴(kuò)增，得到的測序結(jié)果完成序列比對后把持家基因序列合并，利用軟件MEGA7.0分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。參試的9株豌豆根瘤菌代表菌株被分做了2個(gè)類群，第1個(gè)類群中7株代表根瘤菌菌株與已知序列的代表菌株Rhizobium anhuiense CCBAU 23252T序列相似性最高，為99.0%～99.9%，7株代表菌株與剩余的根瘤菌屬模式菌株序列相似性均≤95.7%，所以，該分支中的豌豆根瘤菌可被鑒定為Rhizobium anhuiense。第2個(gè)類群中2株代表根瘤菌菌株與已知序列的代表菌株Rhizobium sophorae CCBAU 03386T序列相似性最高，為≥99.2%，而與剩余的根瘤菌屬模式菌株序列相似性均≤96.0%，所以該分支中的豌豆根瘤菌可被鑒定為Rhizobium sophorae。

2.5 結(jié)瘤基因nod C系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

供試菌的結(jié)瘤基因nodC通過系統(tǒng)發(fā)育分析得到3個(gè)基因型（圖3），基因型1中的豌豆根瘤菌代表菌株nodC基因的序列相似性與Rhizobium multihospitium CCBAU 83401、Rhizobium leguminosarum bv.viciae SWD43-2和Rhizobium laguerreae mlsc02高達(dá)100%，基因型2中的豌豆根瘤菌代表菌株nodC基因的序列相似性與Rhizobium l aguerreae pepv11為99.7%，基因型3中的豌豆根瘤菌代表菌株nodC基因的序列相似性與Rhizobium leguminosarum A1為100%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，供試菌的結(jié)瘤基因具有一定的多樣性。

表2 參試豌豆根瘤菌菌株的IGS PCR－RFLP結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究從棗莊市山亭區(qū)豌豆種植基地一共分離獲得豌豆根瘤菌55株，并通過IGSPCR-RFLP、16S rRNA基因、持家基因和共生基因的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析等對其進(jìn)行分子鑒定和遺傳多樣性的分析。首先，通過IGSPCR-RFLP分析將獲得的豌豆根瘤菌菌分為3種酶切類型；其次，通過16SrRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析確定供試菌屬于根瘤菌屬（Rhizobium）；最后通過持家基因的 （atpD-recA-glnII）MLSA系統(tǒng)發(fā)育分析將供試菌鑒定屬于2個(gè)已知種群，分別是R.anhuiense和R.sophorae。而在這2個(gè)種群中R.anhuiense數(shù)量明顯高于R.sophorae，由此判定R.anhuiense為主導(dǎo)類群，而早在2015年R.anhuiense在安徽和江西地區(qū)的豌豆和蠶豆根瘤中首次被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[9]，又在2016年的研究中確定R.anhuiense是山東半島海岸線上海邊香豌豆主要根瘤菌種群[10]，說明山東地區(qū)土壤中存在R.anhuiense且能與豆科植物形成根瘤。Jiao等在2015年山西地區(qū)的苦參根瘤中首次分離出R.sophorae[9]，Chen等又在四川省的蠶豆根瘤中分離出R.sophorae[19]，本研究中也發(fā)現(xiàn)了該種群的存在，表明該種群具有廣泛的地理分布和適應(yīng)環(huán)境的能力。本研究所獲得的菌株有助于因地制宜地篩選出適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)豌豆根瘤菌菌株，為棗莊地區(qū)豌豆種植基地根瘤菌菌劑的研發(fā)和使用奠定基礎(chǔ)。在結(jié)瘤基因（nodC）系統(tǒng)發(fā)育分析中，供試菌與R.multihospitium、R.leguminosarum及R.laguerreae具有相近的結(jié)瘤基因，表明了豌豆根瘤菌的結(jié)瘤基因具有較好的多樣性。

圖1 參試菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 參試菌株（atpD-rec A-glnII）MLSA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 參試菌株nodC共生基因的系統(tǒng)發(fā)育樹