豬流行性腹瀉病毒反向遺傳操作技術應用現狀

摘要：引起豬腹瀉疾病的病因較多，病毒性腹瀉是最嚴重的一個類型，它是由腹瀉病毒引起的急性傳染性的疾病。近年，豬流行性病毒腹瀉在世界范圍內爆發，為控制該病毒，研究人員建立病毒的靶向RNA重組技術、細菌培養技術、細菌人工染色載體系統等豬流行性腹瀉病毒的遺傳學研究技術，對豬流行性腹瀉病毒的致病機理和疫苗開發有重要意義。該文總結了豬流行性腹瀉病毒反向遺傳操作技術研究現狀及生產實踐中的應用情況，為新型疫苗的研究提供參考。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;反向遺傳學;疫苗研發

中圖分類號：S858.28? ? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.064

Application Status of Reverse Genetic Manipulation of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Abstract：There are many causes of porcine diarrhea disease，and viral diarrhea is the most serious type.It is an acute infectious disease caused by diarrhea virus.In recent years，the swine epidemic virus diarrhea has broken out in the world，and there is no effective method to control the disease so far.To control the virus，researchers have developed targeted RNA recombination techniques，bacterial culture techniques，bacterial artificial stain vector systems，and other genetic research techniques for porcine epidemic diarrhea virus，it is of great significance to the pathogenesis and Vaccine Development of porcine epidemic diarrhea virus.In this paper，the research status of reverse genetic manipulation of porcine epidemic diarrhea virus and its application in production were summarized.

Keywords：porcine epidemic diarrhea virus，reverse genetics，vaccine development

引言

規模化養殖條件下豬的疫病控制較好，但因為有些疾病的關鍵藥物和防治手段不明確，還存在大范圍爆發的可能性。包括豬流行腹瀉病毒、豬傳染性腸胃炎病毒，2種病毒都屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是帶有囊膜的正鏈RNA病毒。因為豬流行性腹瀉病毒分鏈為28 kb，很難對其進行遺傳學反向操作。對其進行研究時要對其遺傳信息進行拷貝，但因為其具有毒性，在拷貝過程中不穩定。目前已成功開發3種豬流行性腹瀉病毒的反向遺傳學操作技術。

1 豬流行性腹瀉病毒反向遺傳學技術

1.1 同源重組技術

靶向同源RNA技術是現在應用較為普遍的分子技術，在重組鼠甘油病毒中首次使用該技術，并獲得完整的感染病毒毒株。冠狀病毒的同源RNA重組主要是利用了輕度的S蛋白的毒性作用，通過替換S蛋白合成基因的方式完成病毒的重組。建立冠狀病毒的豬流行性腹瀉病毒的反向操作技術，分2步完成病毒重組，先是構建鼠源的細胞嗜性的肝炎病毒基因的S蛋白基因的編譯序列，在Vero細胞內進行重組獲得重組豬流行性病毒腹瀉病毒。第1步是選擇構建供體質粒，選擇噬菌體T7RNA聚合酶作為基因編碼序列、orf1a/1b基因、鼠肝炎S蛋白細胞以外的編碼序列與orf3、e、m、n基因的豬流行性腹瀉病毒基因下游序列，將質粒體外轉錄獲得的病毒轉到Vero細胞內，利用LR7細胞篩選出病毒致病基因。第2步是構建包含同基因組區域、攜帶豬流行性腹瀉病毒基因的第2個重組質粒，在質粒構建時可以根據病毒的研究方向，選擇替換致病基因的序列或順序。雖然使用同源重組技術可將病毒進行轉錄，但在轉錄中因為有些區域中含有終止復合酶，在進行轉錄中要先對病毒的終止信號進行鑒別。在進行重組中要對病毒的致病基因進行鈍化，技術較為煩瑣[1]。

1.2 載體反向遺傳操作技術

根據豬流行性腹瀉病毒基因組限制酶切位點的功能特點，將其分為8個片段，每個片段的兩端均選擇合適的限制性酶切位點進行內切，之后再利用脫氧核糖核酸（DNA）鏈將片段合成全長的長鏈DNA。該技術可以減少冠狀病毒的毒性序列在拷貝質粒中復制的不穩定難題，可對病毒所有基因進行剪切整合操作，獲得病毒具有高的表達效率。由于需要引入新的限制性酶切位點，需要認真分析和選擇限制性酶，避免引入內切酶后引起突變影響病毒的復制而導致拯救病毒失敗。

1.3 體外反向遺傳學操作技術

體外反向遺傳技術可避免細菌在細胞內增殖引起病毒的不穩定性，是抑制病毒毒性的最有效措施。按照體外連接的反向遺傳學操作技術，先將體外病毒轉移到長鏈的DNA鏈上，保證病毒基因的穩定，利用核糖核酸（RNA）聚合酶體對該病毒進行轉錄獲得病毒基因組，再將含有致病基因的病毒組轉移到細胞內進行病毒重組。首先利用這種體外組裝技術，獲得大片段的DNA并將冠狀病毒感染性克隆，此技術還可在肝炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、非典型肺炎病毒（SARS）、禽流感和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS）的反向遺傳學操作中應用。

1.4 其他反向遺傳學操作技術

除上文提到的同源重組技術、載體反向遺傳操作技術、體外反向遺傳學操作技術外，目前還有以痘病毒為載體的反向遺傳技術、基于Gibson組裝系統為基礎的反向遺傳技術。雖目前對這2種技術的研究還較少，但是均具有良好的發展前景，值得進行進一步的開發和應用。

2 技術應用現狀

2.1 在豬流行性腹瀉病毒的研究應用

應用反向遺傳技術對豬流行性腹瀉病毒進行研究后發現其對胰蛋白酶具有依賴性，采用反向遺傳后發現S蛋白基因受到胰蛋白酶影響下發生空間構像的改變。在進一步研究中發現S蛋白基因中的T752位點是胰蛋白酶依賴點，這對于病毒體外擴增具有重要意義。

豬流行性腹瀉病毒的主要毒力蛋白S，其具有不同的類型，使用反向基因學可以將這些不同類型的毒力蛋白因子進行剪切，為進一步對病毒的致病力研究提供參考。豬流行性腹瀉病毒的豬圓環病毒3型（ORF3）蛋白是目前發現的唯一一個輔助性蛋白，應用反向遺傳學技術ORF3蛋白可以使分析其他病毒蛋白細胞適應和致病性的影響與ORF3蛋白的影響結合起來成為可能[2]。

2.2 研制新型豬流行性腹瀉疫苗

新生仔豬因為不能及時產生免疫應答能力，自身生產免疫抗原的能力有限，一般是依靠母乳獲得免疫能力。實驗證實豬流行性腹瀉病毒具有直接侵襲小腸膜的能力，這種從母體獲得免疫抗體的方式，可以有效控制病毒的侵害。在對母豬病毒腹瀉抗原的體內變化監測中發現，母豬長期生活在固定環境下，體內會產生大量的病毒性腹瀉抗原，這些抗原會通過乳汁供給仔豬，為仔豬提供免疫能力，但在母豬產后3 d左右免疫抗原的量會急速降低，抗原對仔豬的保護時間較短。豬病毒性腹瀉疫苗主要是通過口服的方式，提高母豬乳汁的面向抗原量，減少仔豬腹瀉的發生。

現在開發的口服疫苗的效果主要依賴疫苗對豬腸上皮細胞上的感染能力，然而豬流行性腹瀉病毒在體外培養過程中影響它作為口服疫苗的病毒效力。通過Vero多代次培養后，Vero細胞適應毒株的能力相比豬流行性腹瀉病毒Dr13親本株培養的免疫疫苗效果差。Chen不同代數毒株培養制成的免疫疫苗，進行口服接種的毒力實驗也證實多代細菌無法感染仔豬的小腸上皮細胞。為了開發有效的豬流行性病毒腹瀉疫苗，接種的疫苗要保持其在體外的高生長性，還要保證毒力的同時必須保持病毒對小腸細胞的適應性。

豬流行性腹瀉病毒反向遺傳學操作及時給新型疫苗的研發提供巨大的潛力。為臨床分離毒株和細胞適應株提供了技術保證，對重組病毒侵入豬小腸上皮細胞機制研究的不斷深入，將進一步揭示消化道內的蛋白酶類對疫苗免疫的作用機制。利用反向遺傳學技術改造體外培養的細胞以增加其小腸細胞適應性[3]。

3 結束語

豬病毒性腹瀉的爆發給養殖業帶來極大沖擊，也對養殖者的效益產生極大損害。目前，反向遺傳學技術的應用給研發新型疫苗提供了技術基礎，以突變或抑制毒力基因表達的形式研制新型疫苗。但是，病毒在不同宿主體內的變異情況不同，其感染機制還不能清楚闡明，雖體外研究方式在一定程度上能解決該問題，但依據體外方式研發的技術類藥品和疫苗在試驗中的效價很低，有時會有諸多不良反應。反向遺傳技術可以針對不同宿主進行病毒致病機理研究，為解決個體差異提供可行的技術手段。

參考文獻

[1] 馬玉騰，韓玉瑩，金鑫，等.非洲豬瘟疫苗研究進展及其難點和突破點[J].中國預防獸醫學報，2021，43（2）：219-225.

[2] 張金晶，王亞娟，丁翊君.多重聚合酶鏈反應結合反向線性點雜交技術檢測新生兒化膿性腦膜炎的病原及其耐藥基因[J].中華圍產醫學雜志，2019（11）：774-780.

[3] 鄭海紅，孫竹筠，張可煜，等.反向遺傳學技術應用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究的進展[J].中國預防獸醫學報，2019，41（10）：1 072-1 076.

作者簡介：王曉蕾（1984-），女，山東煙臺人，本科，獸醫師，從事畜牧獸醫技術推廣、重大動物疫病防控、動物及動物產品檢疫、畜產品質量監督等工作。