扣囊復膜酵母菌對固態混菌發酵體系微生物菌群結構及代謝的影響

王浩,黃丹,2,余東,郭輝祥,鄒永芳,羅惠波,2*

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 自貢,643000) 2(釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室,四川 自貢,643000) 3(舍得酒業股份有限公司,四川 遂寧,629209)

扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)又稱擬內孢霉,屬于子囊菌門(Ascmycota)酵母亞門(Saccharomycotina)下酵母綱(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)復膜酵母屬(Saccharomycopsis),常被發現于具有淀粉質的底物中,由于該酵母為多極芽接和菌絲體形成繁殖而被認為是一種食源性的雙態性真菌[1]。在汾酒大曲[2]、紅曲[3]、濃香型白酒大曲[4]、小曲酒曲藥[5]、醬香型大曲[6]以及發酵前期的酒醅[7-8]等各種酒曲中均有扣囊復膜酵母的存在。周森等[8-9]采用傳統分離方法結合高通量測序對11份清香大曲微生物進行系統研究,在真菌組成中,扣囊復膜酵母是11份大曲樣品的主要真菌,其數量遠高于絲狀真菌和其他酵母菌,占大曲樣品的51.48%～98.32%；馬凱等[10]在汾酒大曲堆中隨機從上、中、下取 3 份大曲樣品,分離出81 株真菌并進行了基于 ITS 基因序列的分子生物學鑒定,結果表明在汾酒大曲中分布的酵母菌中,扣囊復膜酵母是優勢酵母菌種。然而,扣囊復膜酵母在混菌發酵體系中的作用卻鮮有報道。

濃香型大曲生產具有自然接種混菌固態發酵的特點,其微生物來自于糧食原料及環境,而濃香型大曲主要原料是小麥[11]。微生物的生長代謝受溫度、濕度、pH值等環境條件影響,還與大曲微生物之間的相互作用有關[12]。濃香型大曲發酵過程中發現存在扣囊復膜酵母[13]。本研究將從濃香型大曲中分離獲得的扣囊復膜酵母接種于小麥培養基中,空白組為對照,以濃香型大曲制曲過程中重要環境參數溫度、濕度變化為依據,設置發酵條件進行生料發酵。通過研究不同發酵條件下多菌共酵體系中扣囊復膜酵母對微生物多樣性、發酵醅理化參數及重要酶活力、揮發性風味物質等代謝產物的影響,分析扣囊復膜酵母對微生物菌群的擾動作用,為扣囊復膜酵母的強化應用及揮發性風味代謝物的解析提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥,市售的軟質小麥;扣囊復膜酵母菌株,分離自濃香型大曲;Na2EDTA、Na2HPO4、NaH2PO4、蝸牛酶、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),生工生物工程(上海)股份有限公司；異丙醇,天津市津東天正精細化學試劑廠；三氯甲烷,成都市科隆化學品有限公司;Tris-平衡酚(pH>7.8)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)(生化試劑),上海博威生物醫藥有限公司。

1.2 儀器與設備

萃取頭(50/30 μm DVB/CAR on PDMS),上海安譜實驗科技股份有限公司；Agligent 7890A—5975B型氣相色譜-質譜聯用儀,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 固態發酵培養基的制作

所有固態培養基使用同一批小麥,用80 ℃水潤糧4 h,潤糧時翻拌均勻,使小麥充分吸收水分；然后進行粉碎加水攪拌,小麥粉碎要爛皮不爛心,粗細比4∶1,分別將小麥粉分裝在陶瓷托盤中,補充水分使加水量為總質量的30%,最后用8層紗布封住陶瓷托盤。

1.3.2 扣囊復膜酵母菌菌株對微生物菌群的擾動實驗

分別設定發酵溫度/濕度為25 ℃/95%、28 ℃/90%、35 ℃/85%、38 ℃/80%、43 ℃/75%,每個條件下設2個空白組和2個實驗組。實驗組加入從濃香型大曲中分離到的扣囊復膜酵母菌。實驗所取溫度和濕度是根據濃香型大曲在曲房中生產過程及扣囊復膜酵母菌的最高耐受條件設定。所分離的扣囊復膜酵母菌所生長的原始環境為大曲,濃香型大曲的最初發酵溫度/濕度分別為25 ℃/95%,所以開始發酵培養條件為25 ℃/95%,而在分離實驗時,大曲培養條件為43 ℃/75%時沒有分離到這個菌,表明此條件下扣囊復膜酵母在大曲中已經沒有或極少,所以結合大曲生長環境選取5個發酵條件。作圖分析時對應上述發酵條件將空白組標記為KJa0、KJB0、KJc0、KJd0、KJe0,實驗組標記為KJa1、KJB1、KJc1、KJd1、KJe1。

1.3.3 固態發酵物中微生物總DNA的提取

采用文獻報道的方法提取固態發酵物中微生物總基因組DNA[14]。16S擴增子測序使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3～V4可變區進行PCR擴增。ITS擴增子測序使用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GC-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對ITS區進行擴增。

1.3.4 理化及酶活檢測

水分、pH、酸度、液化力、糖化力、發酵力、酒化力的測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》,還原糖含量的測定參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》。

1.3.5 揮發性物質的測定

采用GC-MS對樣品進行測定。揮發性化合物的測定在20 mL頂空瓶中加入2 g大曲樣品、飽和食鹽水。加入20 μL 0.022 64 mg/mL乙酸正戊酯為內標。平衡溫度和萃取溫度為60 ℃,平衡10 min,萃取50 min,解析3.5 min。儀器條件：色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm)；載氣：氦氣(He)；流量：1 mL/min,不分流,進樣口溫度250 ℃；柱溫：起始溫度40 ℃保持1 min,以5 ℃/min升溫至180 ℃保持5 min,再以8 ℃/min升溫至230 ℃保持10 min,運行時間50.25 min。質譜條件：接口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,電離方式為電子電離源,電子能量70 eV,四級桿溫度150 ℃,傳輸線溫度290 ℃,掃描質量范圍20～550 amu。

1.3.6 生物信息學與統計分析

生物信息分析流程使用QIIME2推薦的DADA2方法來去噪去嵌合,為了方便理解,仍以OTU代表這個擴增特征的代表序列。進化樹的繪制由R語言ggtree包完成。選取關注的OTU代表序列進行系統進化分析(每個屬選取一個豐度最高的OTU作為代表,之后再選取豐度最高的前50個屬)繪制進化關系樹圖,同時結合OTU在各個分組的絕對豐度進行熱圖可視化展示。RDA的分析主要依賴R語言VEGAN包,以及用ggplot2進行可視化。

2 結果與分析

2.1 扣囊復膜酵母菌對多菌共酵體系微生物群落多樣性的影響

2.1.1 樣本微生物群落測序深度評價

如圖1所示,通過觀察物種的Shannon稀釋曲線都趨于飽和,這表明測序數據足以評估微生物生態系統的微生物群落。

a-細菌；b-真菌圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of OTUs for all samples

2.1.2 不同發酵條件下扣囊復膜酵母菌對微生物菌群多樣性的影響

采用高通量測序技術對小麥固態多菌種固態發酵體系進行研究,得到空白組和實驗組中微生物群落情況,并分別計算Shannon、Faith’s Phylogenetic Di-versity及Chao1指數來評估微生物群落的豐富度和多樣性,如表1所示。空白組的Chao1、Faith’s Phylogenetic Diversity指數數據明顯低于實驗組且Shannon指數數值大部分高于實驗組,結合分析發現接種扣囊復膜酵母菌后,小麥多菌種發酵體系中物種豐富度明顯降低且均勻度變低。表明實驗組接種扣囊復膜酵母菌后對小麥多菌種發酵體系中的微生物發生了明顯的擾動。

表1 Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index

2.2 扣囊復膜酵母菌對多菌共酵體系微生物群落組成的影響

如圖2所示,空白組與實驗組菌種中優勢微生物組成大致相同,豐度前20的菌種都占微生物總量的98%左右。但相對豐度占比情況發生了明顯變化,實驗組與空白組相比畢赤酵母屬(Pichia)、橫梗霉屬(Lichtheimia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、片球菌屬(Pediococcus)、魏斯氏菌(Weissella)相對豐度占比明顯降低,分別減低了9%、18%、17%、8%、1%,復膜酵母屬(Saccharomycopsis)、芽孢桿菌屬(Bacillus)相對豐度占比明顯增多,分別增多了45%、44%。值得注意的是,實驗組中復膜酵母屬也并非在所有發酵條件下都增加,只有在25 ℃/95%、35 ℃/85%、43 ℃/75%這3個發酵條件下所在的復膜酵母屬有明顯增加,而在28 ℃/90%、38 ℃/80% 的發酵條件下的復膜酵母屬有明顯降低的情況。且在28 ℃/90%發酵條件下,多菌種共發酵體系中未分類的曲霉菌屬(Unspecified_Aspergillaceae)有增加了48.24%,與畢赤酵母屬共占比88.40%；在38 ℃/80%發酵條件下,多菌種共發酵體系中畢赤酵母屬獨占99%。

a-真菌；b-細菌；c-PCA圖2 屬水平的物種相對豐度Fig.2 Relative abundances of microbial community at genus level

將其微生物豐度變化情況進行主成分分析(principal component analysis,PCA),如圖2-c所示,可以觀察到實驗組和空白組微生物組成有明顯變化,解釋度PCA1+PCA2達到81.29%。

2.3 扣囊復膜酵母對固態混菌培養基微生物菌群相互作用的影響

對小麥多菌種共發酵體系中微生物群落進行分析,空白組和實驗組有明顯的差異。為了進一步探討接種扣囊復膜酵母是否影響物種間的相互作用,構建空白組和實驗組微生物群落的相關網絡。分別選取其中相對豐度前10的細菌和真菌,如圖3所示。在實驗組中芽孢桿菌屬(Bacillus)與其他微生物產生了顯著負相關性,而在空白組中芽孢桿菌屬并沒有此特性。在空白組中畢赤酵母屬(Pichia)與未分類曲霉菌屬(Unspecified_Aspergillaceae)、未分類格孢腔菌屬(Unspecified_Pleosporales)、根霉屬(Rhizopus)呈現顯著負相關性,而實驗組中與復膜酵母屬(Saccharomycopsis)呈現顯著負相關性。而假絲酵母屬(Candida_Lodderomyces_clade)與片球菌屬(Pediococcus)在空白組中呈顯著負相關性在實驗組中則呈現顯著正相關性,且與魏斯氏菌屬(Weissella)產生新的顯著正相關性。結果表明,空白組和實驗組多菌種共發酵體系中微生物群落的整體網絡結構發生了明顯的變化。表明扣囊復膜酵母對固態混菌培養基微生物菌群發生了擾動作用,改變了多菌種共發酵體系中微生物群落的整體網絡結構。

a-空白組固態發酵體系的微生物相關性;b-實驗組固態發酵體系的微生物相關性圖3 固態混菌培養體系中微生物的相關性網絡Fig.3 Co-occurrence networks of microbial communities in mixed solid fermentation system注：關聯表示統計上顯著(P<0.05)

2.4 不同發酵條件下扣囊復膜酵母菌對微生物菌群生長代謝的影響

2.4.1 不同發酵條件下扣囊復膜酵母菌多菌共酵體系理化指標的影響

不同發酵條件下小麥多菌種共發酵體系的理化指標如圖4所示,可以看出空白組和實驗組的理化指標變化趨勢大致是相同的,說明接種扣囊復膜酵母菌后依然遵守設定的環境對發酵體系的約束。但接種扣囊復膜酵母菌后測定的理化在各發酵條件下變化情況是不同的。分析小麥多菌種共發酵體系中的理化變化情況可知,實驗組與空白組水分變化情況大致相同,都是隨溫度升高濕度減低而降低。pH變化情況除38 ℃/80%發酵條件下實驗組明顯高于空白組。酸度變化情況是在28 ℃/90%、35 ℃/85%、43 ℃/75%發酵條件下實驗組比空白組明顯降低。結合上述對微生物群落的分析,產酸相關的菌屬片球菌屬(Pediococcus)、魏斯氏菌(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)等實驗組明顯低于空白組。實驗組pH和酸度的變化應是扣囊復膜酵母的接種導致產酸微生物減少的結果。

圖4 不同發酵條件下混菌體系中水分、pH和酸度的變化Fig.4 The changes of water,pH and acidity in mixed solid fermentation system under different fermentation conditions

2.4.2 不同發酵條件下扣囊復膜酵母菌對微生物菌群產酶能力的影響

不同發酵條件下小麥多菌種共發酵體系的酶活力如圖5所示,實驗組與空白組對比,還原糖和糖化力變化情況基本一致。在35 ℃/85%、43 ℃/75%發酵條件下有所降低,在25 ℃/95%、28 ℃/90%、38 ℃/80%這3個發酵條件下皆有所升高；液化力在所有發酵條件下都高于空白組。發酵力在25 ℃/95%、28 ℃/90%、35 ℃/85%這3個發酵條件下實驗組高于空白組。而酒化力影響情況并不明顯。但液化力在所有發酵條件下實驗組都優于空白組。已有的研究表明扣囊復膜酵母有較強的產淀粉水解酶的能力[15],接種后對固態混菌培養基中的酶活力在低溫(38 ℃之前)發酵條件有一定影響。但對實驗組和空白組整體分析影響并不顯著。

圖5 不同發酵條件下混菌體系中還原糖含量、糖化力、液化力、發酵力、酒化力的變化Fig.5 The changes of reducing sugar content,saccharifying power,liquefying power,fermenting power and liquor-producing power in mixed solid fermentation system under different fermentation conditions

2.4.3 扣囊復膜酵母對微生物菌群合成揮發性代謝物的影響

將測定的揮發性化合物與各發酵條件相關性分析并使用正交最小二乘法分析其主成分分析及差異代謝物，如圖6所示。通過GC-MS檢測獲得的不同發酵條件下微生物菌群的揮發性代謝物可知,醇類是含量最多的揮發性代謝物,其余依次是酯類、吡嗪類、酸類、醛類化合物。通過分析實驗結果可知,在25 ℃/95%發酵條件下實驗組與酯類有明顯正相關,35 ℃/85%發酵條件下實驗組與吡嗪類化合物呈現明顯正相關。且通過分析揮發性代謝物物組成,35 ℃/85%、42 ℃/75%這2個發酵條件下,實驗組的吡嗪類化合物明顯增多,分別是空白組的5.7和2.3倍。相對應的發酵條件下微生物群落的變化中芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度有明顯增多,而芽孢桿菌屬(Bacillus)與吡嗪類化合物的合成有緊密關系[16-18]。結合正交最小二乘法分析其主成分分析及差異代謝物,空白組和實驗組的主成分分析有明顯的差異,結合S-plot圖分析其顯著差異的風味物。顯著風味物分別是(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、異戊醇、正己醇、棕櫚酸乙酯、乙酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、肉乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪。實驗組相比空白組,2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、異戊醇、正己醇為顯著增加,(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、棕櫚酸乙酯、乙酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、肉乙酯顯著減少。由結果分析可知,扣囊復膜酵母的擾動導致固態混菌培養體系中揮發性代謝物發生了顯著變化。

a-主要揮發性代謝物的含量；b-揮發性代謝物與發酵條件的相關性熱圖；c-OPLS-DA得分圖；d-S-plot圖圖6 揮發性代謝物變化Fig.6 Changes of volatile metabolites注:b、d圖共用圖例

3 結論

在發酵溫度/濕度為25 ℃/95%、28 ℃/90%、35 ℃/85%、38 ℃/80%、43 ℃/75%條件下,基于混菌固態發酵體系,研究了濃香型大曲中分離獲得的扣囊復膜酵母菌的生長代謝特性。通過分析試驗組和對照組微生物多樣性、發酵過程理化參數及重要酶活力、揮發性風味物質等代謝產物的差異,解析了扣囊復膜酵母菌菌株對多菌共酵體系的擾動作用。結果表明,接種扣囊復膜酵母菌會顯著的影響固態混菌培養基,對畢赤酵母屬(Pichia)、橫梗霉屬(Lichtheimia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、片球菌屬(Pediococcus)、魏斯氏菌(Weissella)有顯著的抑制作用,對芽孢桿菌屬(Bacillus)有顯著增強作用,且會通過抑制產酸微生物進而影響發酵體系的pH、酸度。25 ℃/95%、35 ℃/85%發酵條件下會增強固態混菌體系中淀粉的水解能力,且接種扣囊復膜酵母菌后揮發性代謝物中2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、異戊醇、正己醇為顯著增加,(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、棕櫚酸乙酯、乙酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、肉乙酯顯著減少。在35 ℃/85%、42 ℃/75%發酵條件下,接種扣囊復膜酵母菌后吡嗪類化合物的含量是不接種的5.7和2.3倍。結果表明扣囊復膜酵母在固態混菌發酵體系中起到了至關重要的作用,也為深入研究扣囊復膜酵母在濃香型大曲中的作用提供了重要的數據。