竹筍加工剩余物中筍篼黃酮提取、結構鑒定及生物活性研究

楊波,益莎,施鍇蕓,李琴,楊光,賀亮

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海,200931) 2(國家林業局竹筍工程技術研究中心,浙江省林業科學研究院,浙江省竹類研究重點實驗室,浙江 杭州,310231)

竹筍是廣泛分布于亞洲地區的禾本科、竹亞科多年生常綠植物,其新生芽或嫩莖可食用[1],在中國、日本等亞洲國家是一種食品和藥材來源[2]。竹筍作為綠色產品,口感豐富且富含膳食纖維、酚類、多糖、黃酮等營養成分[3-6],具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗腫瘤[7-9]等生物活性,已被開發成了竹筍功能飲料[10]、防腐劑[11]等。然而隨著中國竹筍加工工業的迅猛發展,產生了大量的加工剩余物如筍殼、筍篼、筍煮水等[12]。這些剩余物給環境帶來污染的同時也對資源造成了極大的浪費,因此如何處理竹筍加工剩余物也越來越受到人們的重視。

黃酮類物質作為竹筍加工剩余物中一類營養成分[13],具有多種生理活性,可清除體內自由基[14]、抗腫瘤[15]、降血糖[16]等。黃酮類物質種類豐富,目前對于竹筍加工剩余物中黃酮類物質構成研究主要集中于筍殼、竹葉等,其碳苷類物質主要為牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷[17]。對于其他竹筍加工剩余物如筍篼中的黃酮類物質構成尚不明確。

筍篼位于竹筍根部,在竹筍加工中是直接被棄用的部分,但是這一部分在竹筍加工剩余物中占比約60%。目前,利用細胞的體外培養研究筍篼黃酮(flavonoids from bamboo shoot processing residue,BSDF)相關活性的文獻報道尚不多見。因此,本實驗以筍篼為研究對象,醇提法提取筍篼中的黃酮類物質,并利用響應面對其提取條件進行了優化。同時,利用液質聯用技術對BSDF中黃酮碳苷類物質進行鑒定,得到主要成分。最后,通過分析加入BSDF后HepG2細胞的活性變化及HepG2-IR細胞葡萄糖消耗量的變化研究了BSDF的體外抗腫瘤及降血糖活性。本文研究了竹筍加工剩余物中BSDF的提取、結構和生物活性,為其工業化應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

筍篼(烘干、粉碎),浙江省杭州市余杭區徑山竹茶園；蘆丁標準品(純度≥98%),阿拉丁試劑有限公司；95%乙醇(分析純)、石油醚(30～60 ℃)、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、甲酸,成都市科隆有限公司；甲醇(色譜醇),羽宸精細化工有限公司；DMEM高糖培養基,武漢Procell公司；葡萄糖檢測試劑盒,金客隆生物技術有限公司；CCK-8,北京智杰方遠科技有限公司。

恒溫水浴鍋、電子天平,常州市億能實驗儀器廠；旋轉蒸發儀,上海亞榮生化；冷凍干燥機,廈門東亞機械工業；可見分光光度計,上海美析儀器；UPLC-Triple-TOF/MS系統：AcquityTMultra型高效液相色譜儀,美國沃特世；Triple TOF 5600+型飛行時間質譜,美國丹納赫；Eppendorf minispan離心機,德國艾本德。

1.2 實驗方法

1.2.1 筍篼預處理

新鮮筍篼洗凈烘干、磨碎。稱取適量樣品,加入一定體積65%(體積分數)乙醇溶液,70 ℃水浴60 min。重復抽濾2次后合并濾液,濃縮凍干后保存備用。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

以王杰等[18]的方法為基礎,略有修改。蘆丁溶解在60%乙醇中,配制成2 mg/mL的母液,然后用水稀釋10倍。吸取0、0.25、0.5、1、2、3、4、6 mL到25 mL試管中,加1 mL 50 g/L的NaNO2溶液,搖勻靜置6 min；加1.5 mL 100 g/L的Al(NO3)3溶液,搖勻靜置6 min；加4 mL 200 g/L的NaOH溶液,使用體積分數60%的乙醇定容。搖勻靜置15 min,在波長510 nm處測定吸光度。得到蘆丁標準曲線為y=0.098 31x-0.004 75,R2=0.999 11。

1.2.3 BSDF含量測定

稱取適量凍干后的BSDF樣品,用體積分數60%的乙醇稀釋到適宜濃度。按照1.2.2 中方法測定BSDF的吸光值。用標準曲線計算得出BSDF樣液中黃酮濃度。計算如公式(1)所示：

(1)

式中,ρ,提取液濃度,mg/L；V,提取液體積,L；N,稀釋倍數；m,筍篼原料質量,g。

1.2.4 BSDF提取條件優化

分別以乙醇體積分數(45%、55%、65%、75%、85%)、液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1)(mL∶g)、提取時間(20、40、60、120、180 min)提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)為單因素檢測不同條件下BSDF的提取率。響應面設計提取條件優化實驗見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Response surface experimental design

1.2.5 BSDF碳苷類物質的UPLC-Triple-TOF/MS檢測

采用聚酰胺樹脂吸附純化BSDF樣品,收集40%乙醇的洗脫溶液,濃縮后凍干,備用。取適量凍干后BSDF樣品用色譜級甲醇溶解,離心后用0.45 μm有機微孔濾膜過濾,備用。

色譜條件：流動相A為0.2%磷酸溶液,流動相B為體積分數0.2%的磷酸乙腈溶液；線性梯度洗脫:0 min,5%B;10 min,40%B;17 min,95%B;洗脫流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；λ=280 nm；進樣量4 μL。質譜條件：正負離子掃描模式；m/z100～1 500；霧化氣(GS1、GS2)55 psi；氣簾氣(CUR)35 psi；離子源溫度600 ℃(正)、550 ℃(負)；離子源電壓-4 500 V(負)、5 500 V(正)。

1.2.6 BSDF生物活性研究

1.2.6.1 BSDF對HepG2細胞的抑制作用

本實驗以HepG2細胞來研究BSDF體外抗腫瘤活性。采用DMEM高糖培養基在37 ℃,體積分數5% CO2培養箱里培養HepG2細胞。當細胞貼壁率達80%以上,棄去原培養基,PBS清洗2遍后用胰蛋白酶消化細胞。消化完成后用DMEM重懸細胞輕輕吹打均勻,細胞計數板計數后調整細胞密度,按照1.5×104cells/mL、200 μL每孔鋪板于96孔板中培養24 h。實驗組分為低、中、高劑量組,BSDF質量濃度分別為200、400、800 μg/mL,對照組則繼續用培養基培養。繼續培養24 h后,每孔加入20 μL CCK-8試劑,繼續培養1 h后,用酶標儀在波長450 nm處檢測各孔吸光度。細胞增殖越多,則顏色越深,吸光值越大；細胞毒性越大,則顏色越淺,吸光值越小。細胞抑制率按公式(2)計算:

(2)

1.2.6.2 BSDF降糖活性研究

按照1.2.6.1中方法處理細胞,調整細胞密度為1.5×104cell/mL，然后以200 μL每孔鋪板于96孔板中。培養24 h后,正常組更換DMEM完全培養基,模型組更換為胰島素培養基(15 μg/mL)以建立胰島素抵抗模型。繼續培養24 h,建立正常組(對照組)、胰島素抵抗模型組(IR)、二甲雙胍陽性對照組(MET,100 μg/mL)、BSDF低、中、高濃度組(200、400、800 μg/mL),繼續培養24 h。取各組細胞上清液2 μL,分別加入葡萄糖檢測試劑200 μL,繼續培養1 h后在波長505 nm處檢測各孔吸光度值。以不加細胞實驗組為空白組,葡萄糖消耗量=空白組細胞葡萄糖含量-給藥組細胞葡萄糖含量。以CCK-8法測定細胞毒性。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對BSDF提取率的影響

圖1中,BSDF提取率在乙醇體積分數小于65%時呈上升趨勢,大于65%后呈下降趨勢,最高值在65%處。因此,提取溶劑體積分數選擇65%。

圖1 乙醇體積分數對BSDF提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of BSDF

2.1.2 提取時間對BSDF提取率的影響

如圖2所示,隨提取時間延長,BSDF提取率也逐漸上升。在50～60 min時,BSDF提取率提升較大。這是由于當提取時間較短時,筍篼黃酮類化合物不能充分溶解出來。實驗應在盡量短的時間內高效提取出黃酮,因此選擇60 min來提取BSDF。

圖2 提取時間對BSDF提取率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate of BSDF

2.1.3 液料比對BSDF提取率的影響

如圖3所示,BSDF提取率變化情況與圖1相似,最高值出現在液料比為25∶1(mL∶g)。因此,以25∶1(mL∶g)為BSDF提取液料比。

圖3 液料比對BSDF提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of BSDF

2.1.4 提取溫度對BSDF提取率的影響

如圖4所示,BSDF提取率隨溫度的上升而增加,這可能是由于溫度升高增大了黃酮在乙醇中的溶解度。但當溫度過高,易造成提取液中活性成分被破壞,考慮乙醇沸點為78.4 ℃,選取70 ℃為實驗溫度。

圖4 提取溫度對BSDF提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of BSDF

2.2 BSDF的提取優化結果

2.2.1 響應面回歸模型建立及分析

本研究根據 Box-Benhnken 原理在單因素試驗的基礎上,設計3因素3水平的響應面試驗,共計17 組。其方差分析如表2所示。

表2 響應面方差分析Table 2 Response surface analysis of variance

由表2可知,響應值BSDF提取率模型顯著。交互二次回歸方程的F檢驗和失擬性檢驗結果表明,模型P<0.000 1,失擬項P>0.05,說明模型極顯著且擬合程度好,故該模型可用來進行分析和預測。

2.2.2 交互項的響應面曲線圖

交互作用的響應面曲線圖(圖5)反映了各因素對BSDF提取率的影響。由回歸方程預測到最優提取組合為乙醇體積分數55%、液料比27∶1(mL∶g)、提取時間66 min,此條件下提取率最高為0.33%。

a-乙醇體積分數與液料比;b-乙醇體積分數與提取時間;c-液料比與提取時間圖5 三因素交互作用對BSDF提取率影響Fig.5 The interaction of three factors affects the extraction rate of BSDF

2.3 筍篼黃酮碳苷類物質UPLC-Triple-TOF/MS鑒定結果

將經過聚酰胺樹脂純化后的BSDF樣品進行UPLC-Triple-TOF/MS測定,得到其中主要的組成成分,并明確其中的黃酮苷類物質。發現筍篼黃酮類物質中主要含有黃酮苷類、黃酮醇類等物質?？傠x子流如圖6所示,其中主要的黃酮苷類物質鑒定為以下4種。

圖6 總離子流圖Fig.6 Total ion mass spectrogram

對圖7的4種化合物1、2級質譜圖進行分析，得到化合物Ⅰ(4.062 min)：1 級質譜中準分子離子峰[M-H]-563.137 9,分子式為C26H28O14；二級質譜中生成m/z503 [M-H-60]-、m/z473 [M-H-90]-、m/z443 [M-H-120]-、m/z383 [M-H-120-60]-和m/z353 [M-H-120-90]-的碎片離子?？芍衔铫裰饕呀馐サ乃槠瑸辄S酮C-苷類物質的特征碎片：60、90、120 Da。此結果與劉芹燕等[19]的實驗進行對照,說明此化合物為夏佛塔苷。

a-化合物Ⅰ；b-化合物Ⅱ；c-化合物Ⅲ；d-化合物Ⅳ圖7 四種BSDF碳苷類化合物的1、2級質譜圖Fig.7 Compound Ⅳ mass spectrogram

化合物Ⅱ(4.719 min)：1 級質譜中準分子離子峰[M-H]-533.127 0,分子式為C25H26O13；二級質譜中生成m/z515 [M-H-H2O]-、m/z443 [M-H-90]-、m/z383 [M-H-120-60]-和m/z353 [M-H-120-90]-的碎片離子,也屬于黃酮C-苷類物質的特征離子。結合化合物分子式結構,推斷該化合物應為芹菜素-6,8-C-二那阿拉伯糖苷。

化合物Ⅲ(5.459 min)和化合物Ⅳ(5.628 min)：兩者為同分異構體,1級質譜中它們的準分子離子峰分別為[M-H]-547.1469、[M-H]-547.1437,分子式為C26H28O13；在二級質譜中兩者都含有m/z487 [M-H-60]-、m/z457 [M-H-90]-、m/z427 [M-H-120]-,這些都是黃酮C-苷類化合物特征離子碎片。結合文獻[20],化合物Ⅲ為白楊素-6-C-β-D-葡萄糖苷-8-C-α-L-阿拉伯糖苷,化合物Ⅳ為白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷。

2.4 BSDF的生物活性研究

2.4.1 BSDF的抗腫瘤活性檢測結果

黃酮類物質的抗腫瘤活性近年來一直被人們廣泛關注[21]。加入不同濃度BSDF(低、中、高)后HepG2細胞的活性如表3所示。與對照組相比,BSDF質量濃度與HepG2細胞活性抑制率成正比,隨著BSDF質量濃度的增加細胞活性逐漸降低。一般認為,腫瘤藥物敏感性試驗結果與體內化療療效總符合率達到85%[22],這說明BSDF對HepG2細胞增殖具有較強的抑制作用。

表3 不同濃度BSDF對HepG2細胞活性的影響Table 3 Effect of BSDF concentration on cell viability of HepG2

2.4.2 BSDF的降血糖活性檢測結果

本實驗通過高濃度胰島素誘導HepG2細胞,建立體外胰島素抵抗模型來判斷BSDF的降糖活性。胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病主要的誘因之一,是指組織對胰島素的敏感性下降,代償性引起胰島β細胞分泌胰島素增加,從而產生高胰島素血癥,其實質為胰島素介導的細胞糖代謝能力的減低[23]。建立胰島素抵抗模型可通過高糖、高脂、高胰島素來進行誘導,本實驗選擇高濃度胰島素誘導HepG2細胞建立,因此,需要選擇合適的胰島素濃度,建模成功后給藥,通過葡萄糖消耗量的變化確定BSDF的降糖效果。

加入胰島素(2.5,5,15,30,60 μg/mL)誘導HepG2細胞,葡萄糖含量檢測結果見表4。當胰島素質量濃度在15 μg/mL時,與對照組相比,葡萄糖消耗量降低2.01 mmol/L,說明此濃度下的胰島素影響了HepG2細胞正常的葡萄糖攝取,產生了胰島素抵抗的效果。而且此濃度對細胞活性影響最小。因此,選擇15 μg/mL來建立HepG2-IR模型。

表4 不同質量濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗量及細胞活性的影響Table 4 Effect of insulin concentration on glucose consumption and cell viability of HepG2

2.4.3 BSDF對HepG2-IR細胞的影響

成功建立HepG2-IR細胞模型后,分別加入200、400、800 μg/mL的BSDF繼續培養。24 h后測定其葡萄糖消耗量及細胞活性。發現僅在BSDF-800組細胞活性降低到95%左右,如圖8所示,而其余組細胞活性沒有明顯變化。圖9中,BSDF各組與IR組相比葡萄糖消耗量有所增加,具有顯著性差異。這說明不同濃度下的BSDF都能夠促進IR組細胞對葡萄糖的攝取利用,綜合圖8結果來看,當BSDF質量濃度為400 μg/mL時具有最佳的降糖效果。

圖8 不同質量濃度對HepG2-IR細胞活性的影響Fig.8 Effect of BSDF concentration on cell viability of HepG2注：IR為模型組；MET為二甲雙胍組；BSDF-200、BSDF-400、BSDF-800為BSDF不同濃度組(下同)

圖9 不同質量濃度BSDP對HepG2-IR細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.9 Effect of BSDF concentration on glucose consumption of HepG2.

3 結論

本研究以筍篼為原料,并從中提取功能性成分黃酮。利用響應面優化了BSDF提取最佳工藝為：乙醇體積分數55%、液料比27∶1(mL∶g)、提取時間66 min,BSDF提取率最高為0.33%。對經過聚酰胺樹脂柱純化后的BSDF干粉通過UPLC-Triple-TOF/MS技術,鑒定BSDF中碳苷類物質,發現主要有4種。以質譜圖為依據,根據碎片離子峰,推斷出這4種化合物可能為夏佛塔苷、白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6,8-C-二那阿拉伯糖苷、白楊素-6-C-β-D-葡萄糖苷-8-C-α-L-阿拉伯糖苷。但這4種化合物準確的結構信息還有待進一步鑒定分析。BSDF體外活性研究表明,BSDF對人肝癌細胞HepG2有一定的抑制作用,且隨著濃度增加其抑制作用也呈現增強趨勢；在降糖方面,BSDF可以改善15 μg/mL胰島素誘導的HepG2細胞葡萄糖消耗情況,起到一定的降糖作用。其中,降糖效果最佳且不對細胞活性造成影響的BSDF質量濃度為400 μg/mL。這表明HepG2細胞對胰島素的敏感性可能是BSDF防治2型糖尿病的作用機制之一[24]。然而,當BSDF質量濃度為800 μg/mL時,HepG2細胞活性降低,因此其降糖作用也不能排除細胞增殖方面的影響,這還有待進一步研究。

本研究對BSDF的提取條件進行了優化,鑒定了BSDF中碳苷類化合物,并對其體外活性進行了簡單的研究探討,明確了其部分結構信息及活性。但是,對BSDF活性方面的研究還需要更深入的了解,對于其活性機制如蛋白、基因等方面的表達還有待進一步探討。