miR-101、miR-122在妊娠期糖尿病患者血清和胎盤組織中表達及意義

陳麗霞，張秀薇，禤文婷，尹鎮釗，陳松錦 （廣東省東莞市人民醫院內分泌科，廣東東莞 523000）

妊娠期糖尿病（GDM）是妊娠期較為常見的并發癥，其指妊娠起始或妊娠過程中出現葡萄糖耐量受損。目前對于GDM 發病機制尚不十分明確，既往相關研究指出孕產婦高雌激素水平與其胰島素抵抗有關，認為胰島素抵抗是GDM 重要的病理機制[1]。近年來，隨著GDM發生機制的研究進展，越來越多的研究證實多種miRNA 直接或間接參與GDM 的生物學行為機制進程，其中miR?101 可在轉錄后調節多種基因的表達，與糖脂代謝異常、炎癥反應等密切相關[2]；而miR?122 也被證實其參與了胰島素分泌、糖酵解、脂肪細胞分化等生物學過程的調控[3]。因此，筆者認為兩者可能與GDM的發生與進展、胰島素抵抗、炎癥反應、胎盤滋養層細胞的遷移與侵襲等具有一定關聯。因此，本研究通過分析GDM 患者血清及胎盤中miR?101 和miR?122 的表達水平情況，分析其與胰島素抵抗的相關性，以明確miR?101與miR?122在GDM預測、治療及預后中的作用及意義。

1 資料和方法

1.1 病例與分組

選取2018年7月至2019年12月在東莞人民醫院建檔產檢并分娩的GDM 孕婦42 例為觀察組。納入標準：(1)符合GDM 診斷標準，即行口服葡萄糖耐量試驗顯示：空腹血糖≥5.1 mmol/L；1 h血糖≥10.0 mmol/L；2 h 血糖≥8.5 mmol/L，滿足任意一項即可診斷為GDM；(2)妊娠>16周；(3)在本院規律產檢。排除標準：(1)既往無糖尿病或糖尿病家族史；(2)妊娠期高血壓、高血脂、心臟病等其他妊娠合并癥；(3)雙胎妊娠；(4)全身感染性疾病。本研究已通過本院醫學倫理委員會批準，患者及家屬知情且簽署同意書。并隨機選取同期健康孕婦30例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有孕產婦均于清晨空腹時采集靜脈血取血清，?20 ℃冰箱中待檢。胎盤組織獲取于胎兒與胎盤娩出后，生理鹽水洗凈，取胎盤中央母體面臍帶根部組織5 mm×5 mm×5 mm 大小2～4 塊組織物，約重120 mg，靜置?80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 RNA 提取 采用RNAeasy extraction Kit 試劑提取血清RNA，用Trizol 試劑提取胎盤組織中RNA，同時采用Nanodrop 2 000 紫外可見分光光度計進行兩樣本中RNA 濃度及純度檢測。所有步驟均按試劑盒說明操作。

1.2.3 miRNA 逆轉錄 采用miRNA 逆轉錄及特異性檢測試劑盒，引物采用miR?101 特異性RT?PCR 引物（Forward:5'?CATCTTACCGGACAGTGCTGGA?3'，下游為通用引物）檢測miR?101 的表達。采用miR?122特異性引物（Forward：5'?TGGAGTGTGACAATG?GTGTTTG?3’，下游為通用引物）miR?122的表達。

1.2.4 熒光實時定量PCR 試劑盒使用TaKaRa 公司，反應參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環。熔解曲線檢測從65 ℃開始，每0.5 ℃檢測1 次。miRNA 表達量以2?ΔCt 表示，其中ΔCt=CtmiRNA–CtU6。

1.3 觀察指標

(1)臨床參數指標：年齡，身體質量指數（BMI）。(2)胰島素抵抗相關指標：取血清，采用全自動電化學發光分析儀空腹血糖（FPG）及空腹胰島素（FINS），胰島功能采用穩態模型計算HOMA 胰島素抵抗指數（HOMA?IR）=（FPG×FINS）/22.5，HOMA 胰島素分泌指數（HOMA?IS）=（20×FINS）/FPG?3.5。(3)兩組血清及胎盤中miR?101與miR?122表達水平差異。

1.4 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以表示，采用t檢驗；采用Pearson 相關性分析血清miR?101與miR?122水平與臨床參數和胰島素抵抗相關指標的相關性。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床參數和胰島素相關指標

觀察組孕產婦BMI、FBG、FINS、HOMA?IS 及HOMA?IR 指標均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05 或0.01），見表1。

表1 兩組臨床參數和胰島素相關指標比較 ()

表1 兩組臨床參數和胰島素相關指標比較 ()

與對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

2.2 miR?101 和miR?122 在兩組血清和胎盤組織中表達水平

miR?101和miR?122在觀察組血清和胎盤組織中表達水平均明顯高于對照組（P<0.01），見表2 和圖1、2。

圖1 miR?101的qPCR擴增曲線圖

表2 miR?101和miR?122在兩組血清和胎盤組織中表達水平比較 ()

表2 miR?101和miR?122在兩組血清和胎盤組織中表達水平比較 ()

與對照組比較：aP<0.01

2.3 各項指標與血清miR?101 及miR?122 水平的相關性分析

血清miR?101 水平與FBG 呈正相關，與FINS、HOMA?IS 呈負相關（P<0.05）；miR?122 水平與FBG、HOMA?IR 呈正相關，與FINS 呈負相關（P<0.05），見表3。

表3 各項指標與血清miR?101及miR?122水平的相關性分析

3 討論

當前，隨著孕婦飲食結構及生活方式的改變，GDM 發病率呈逐年上升趨勢。GDM 易造成較多種不良妊娠結局，對母嬰均有嚴重危害，甚至長遠影響，早期診斷并及時治療可提高孕婦及胎兒的預后[4]。因此，新的生物學標記物在早期診斷GDM 尤為重要。miRNA 是一類進化過程高度保守的、廣泛參與多種疾病的發生與進展的小分子非編碼RNA，其在代謝調控和細胞功能中起到“動態調節器”的作用[5]。而近年來miRNA與GDM 的相關研究較為新穎，同時也為本研究提供了理論支持。

圖2 miR?122的qPCR擴增曲線圖

本研究結果顯示，miR?101及miR?122水平在GDM 患者血清及胎盤組織中均呈高表達，提示兩者可能直接或間接參與了GDM的發生和發展。有多項研究證實，miR?101 可通過調控EZH2/H3K27me3 通路參與調控多種疾病的進展，其中在胚胎橫紋肌肉瘤、肺癌、膀胱移行細胞癌中，其通過降低EZH2/H3K27me3 表達，從而抑制細胞增殖來影響腫瘤進展[6?8]。胎盤形成的前提是胎盤滋養細胞對母體子宮內膜的侵入及黏附，而miR?101 在此過程中可能通過調控EZH2/H3K27me3 通路來影響胎盤滋養細胞的功能，導致胎盤滋養細胞遷移及增殖能力降低，參與GDM 發病[9]。而針對miR?122 而言，其是前體基因位于18q21.31位點，參與了糖酵解、脂肪細胞分化、胰島素分泌等代謝相關的生物學過程調控[10?11]。在胰島素抵抗細胞模型中，miR?122 呈高度表達，而通過轉染miR?122 模擬物，AMPK 基因表述水平下調，進而加重胰島素抵抗程度[12]。另外，胰島素抵抗水平是胰島細胞功能的一個重要指標，本研究在GDM 產婦胰島素抵抗相關指標均比正常產婦的明顯增高，且在相關性分析中，GDM 產婦血清miR?101 水平與FBG 呈正相關，與FINS、HOMA?IS 呈負相關；miR?122 水平與HOMA?IR、FBG 呈正相關，與FINS 呈負相關。說明GDM 產婦在胰島素分泌狀態下，產婦血清miR?101表達顯著下調；而產婦呈胰島素抵抗狀態時，其血清miR?122 表達顯著上調，miR?122 部分的結果與禤文婷[3]等的研究結果基本一致，但對于miR?122 作用的靶向信號通路仍需作進一步的研究與探討。

綜上，miR?101及miR?122水平在GDM產婦血清及胎盤中均呈高表達狀態，其可能直接或間接參與了GDM 的發生和發展。此外，miR?101 表達與胰島素分泌指數呈負相關；miR?122 表達則與胰島素抵抗指數呈正相關，因此可推斷，通過干預miR?101 及miR?122 表達，可阻止胰島細胞功能的抑制或分泌，或可能成為GDM診斷、治療及預后的新靶點。