乳酸降解菌在白酒釀造中的研究進展

王新葉，李芳香，張依香，鐘艷霞，莫新良，趙 亮

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564500）

乳酸（2-羥基丙酸）（C3H6O3）及其酯類是中國白酒中重要的成分，其在各香型酒中所占的比重差異較大[1]。在清香型白酒中，乙酸乙酯和乳酸乙酯的絕對含量及兩者之間的比例關系，對清香型白酒的質量和風格特征有很大的影響，一般乙酸乙酯與乳酸乙酯的含量比例為1∶（0.6～0.8）左右[1]。在濃香型白酒中，四大酯（己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯）、四大酸（己酸、乳酸、乙酸和丁酸）占酒體中酯、酸類物質的98%以上，其中己酸乙酯與乳酸乙酯的比值多在1∶（0.5～0.8）之間[2]。但在白酒生產過程中，普遍存在乳酸乙酯含量過高的問題，導致乳酸乙酯與主體香的比例失調，嚴重影響白酒的品質[1，3]。

在白酒釀造過程中，乳酸乙酯的產生是多種微生物代謝作用的結果，它分別由乳酸菌代謝產生的乳酸和酵母菌代謝產生的乙醇來提供酯化的前體，然后在丁酸菌等微生物提供的酯化酶作用下酯化生成[4]。乳酸乙酯性質穩定，不易被分解，可以通過降低乳酸乙酯的前體物質——乳酸，降低白酒中的乳酸乙酯含量[5]。在白酒生產過程中，實現“降乳”主要有以下幾種方式：①添加輔酶，添加食用級富馬酸可以抑制乳酸菌生長。然而添加富馬酸會增加白酒釀造成本，同時也會干擾微生物的其他代謝途徑；②控制與優化生產工藝：使用優質陳曲，減少用曲量；緩火蒸餾，量質接酒；及時清理黃水，確保生產環境衛生。通過優化操作工藝，可以在一定程度上降低生產過程和基酒中乳酸乙酯的含量，但是“治標不治本”；③在發酵過程中添加乳酸降解菌，這些乳酸降解菌株來源于發酵過程，成本低，不影響其他微生物的生長代謝[6]。

已見報道的乳酸降解菌主要是從清香型白酒、濃香型白酒和特香型白酒的釀造過程篩選出來的8個屬，種質資源有待進一步開發。醬香型白酒生產過程中，乳酸是酒醅中的主要酸類物質，在中后期輪次酒醅中乳酸含量可以達到20～40 g/kg酒醅，在醬香型白酒這樣酸性釀造環境的脅迫和馴化下，一些釀造微生物已經對乳酸具有較強的耐受性和利用能力[7]。因此，醬香型白酒的釀造環境可以作為乳酸降解菌菌種的種質資源庫，為篩選獲得具有應用價值的乳酸降解菌提供原材料。

1 乳酸降解菌的種類

乳酸降解菌也稱乳酸利用菌，是指能夠利用乳酸作為碳源或者電子受體的一類微生物[6]。在釀酒環境中，乳酸降解菌在大曲、窖泥和酒醅中都有分布，大部分是兼性厭氧菌[5-6，8-9]。已見文獻報道的乳酸降解菌有丙酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、泥桿菌屬、脫硫腸狀菌屬、葡萄球菌屬、土孢桿菌屬等[6，10]。丙酸桿菌屬的菌株是報道最早的乳酸降解菌[10-11]。芽孢桿菌屬的菌株最多，包括解淀粉芽孢桿菌、芹菜芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、富馬芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、半乳糖芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及特基拉芽孢桿菌的15個菌株[5，9，12]。其次是梭菌屬，包括七葉梭菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、丁酸梭狀芽胞桿菌、天青梭狀芽胞桿菌、耳蝸梭狀芽孢桿菌、馬氏梭狀芽胞桿菌、玫瑰梭狀芽孢桿菌、塞內加爾氏梭菌、梭狀芽孢桿菌、產芽孢梭狀芽孢桿菌、酪丁酸梭菌的11個菌株[13-15]。

不同種屬的菌株對乳酸的降解率差異很大，芽孢桿菌屬的菌株中，除個別菌株外，大部分菌株對乳酸的降解率都能達到100%[9]；梭菌屬的菌株中，耳蝸梭狀芽孢桿菌對乳酸的降解率能達到90%以上，其他種的菌株對乳酸的降解率均低于70%[6]。其他屬的菌株中，泥桿菌屬對乳酸的降解率為100%，脫硫腸狀菌屬、拉烏爾菌屬、葡萄球菌屬、土孢桿菌屬的菌株對乳酸的降解率均在40%以下[6]。

乳酸降解菌的發酵產物主要有醇類、酸類和酯類。不同屬的乳酸菌發酵產物不同，芽孢桿菌屬的菌株發酵都會產生乙醇，而梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、泥桿菌屬、土孢桿菌屬的菌株發酵都不產生乙醇，但會產生丁醇、戊醇、己醇和辛醇等[6，9]。而不同來源的乳酸降解菌發酵產物也有一定差異，鎮達等[9]從黃水、酒糟、大曲中分離得到的乳酸降解菌都屬于芽孢桿菌屬，但是來源于黃水的乳酸降解菌發酵產物只有乙醇，而來源于大曲的乳酸降解菌的發酵產物除乙醇外，還有丙酸、己酸、異丁醇和異戊醇等。

2 乳酸降解菌的篩選

2.1 培養基的優化

乳酸降解菌可以以乳酸或乳酸鈉作為碳源，研究者們在篩選培養基中，添加乳酸或乳酸鈉作為唯一碳源，將能在此類選擇性培養基上生長的菌株初步認定為乳酸降解菌[6，16]。張國政等[16]最先以“乳酸鈉1.0%，酵母膏0.5%，無機鹽適量”為基礎培養基從酒醅、窖泥和黃水中篩選出了190株乳酸降解菌，但其中只有10株菌的乳酸降解能力較強，降乳率在30%～60%之間。鎮達等[9]以“每升含5 g乳酸，2 g酵母膏，2 g（NH4）2SO2，14.3 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，0.28 mg MnSO4·H2O，0.3 mg FeSO4·7H2O，0.06 mg MgSO4·7H2O，1 mg CaCl2，0.05 mg CuSO4，0.05 mg ZnSO4和0.05 mg H3BO3”的培養基從窖泥、出窖酒糟、黃水和大曲中分離篩選得到了16株乳酸降解菌，其中11株菌的乳酸降解率達到了100%，大部分菌株的乳酸降解率在60%以上。

2.2 具有耐受性的乳酸降解菌的篩選

酒醅是白酒發酵的主要載體基質，其微環境具有高濃度乙醇、高濃度有機酸、低pH等特點[6，17]。因此，菌株在高酸、高乙醇濃度下的降乳率也是重要的考察指標。

在白酒發酵過程中，伴隨著營養物質的降解和微生物的繁殖生長，代謝生成大量有機酸使發酵酒醅維持酸性環境，瀘型酒酒醅入窖時其pH值一般為4.0～5.0，發酵結束時維持在3.5～4.0左右[9，16]。隨著pH的降低，菌株的乳酸利用率呈現下降趨勢，而不同菌株對pH的耐受性差異很大。菌株Z4-5在pH 4條件下依然能夠利用乳酸鈉，降乳率可達到20%[16]。但是，大多數乳酸降解菌在pH 5以下無法生長[6，18]。這可能是由于對菌株pH耐受性的檢測是在實驗室液體發酵條件下進行的，而同樣的酸度條件下液體環境會加強酸的抑制作用，某些可以在固態發酵條件下繁殖生長的微生物無法在液體培養條件下生存[18]。

高濃度的乙醇耐受能力是乳酸降解菌應用的前提，但目前研究獲得乳酸降解菌的乙醇耐受能力并不理想。酒精度在4%vol以下，大部分乳酸降解菌都能快速生長；乙醇含量超過6%，菌株的乳酸降解率大幅度下降，而且大部分菌株生長受到明顯抑制[6，16，18]。

乳酸是酒醅中含量最高的有機酸，在瀘型酒中，發酵結束時其質量濃度范圍在15～20 g/L酒醅左右，而在醬香型酒中，中后期輪次酒醅中乳酸含量達到20～40 g/kg酒醅[6-7]。王莉等[7]從醬香型白酒發酵酒醅中篩選到了一株庫德里阿茲威氏畢赤酵母MY-Y01，對乳酸的耐受性可達到120 g/L，是醬香型白酒發酵過程中一株重要的酵母菌。

3 發酵液中乳酸含量的測定方法

乳酸是自然界最小的手性分子，主要由微生物發酵產生[21]。發酵液中乳酸的測定方法主要有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法、對羥基聯苯比色法、酶電極分析法及高效液相色譜法，發酵液中乳酸含量的測定方法見表1。

由表1可知，EDTA滴定法和對羥基聯苯比色法簡便快速，但重復性較差；酶電極分析法和高效液相色譜法測定更準確靈敏，但是成本相對測試成本較高[21]。此外，選擇何種測定手段還受測定方法的成本以及對檢測速度要求的影響[21]。

表1 發酵液中乳酸測定方法比較Table 1 Comparison of lactic acid determination method in fermentation broth

4 乳酸降解菌在白酒生產中的應用

國內對乳酸降解菌的應用研究始于20世紀80年代，由于丙酸菌在無氧狀態下發酵可以將乳酸轉變成二氧化碳、乙酸、丙酸和少量的琥珀酸，可以起到降低酒醅中乳酸含量的作用，因此丙酸菌是被最早應用在白酒生產上的菌種[10，26]。20世紀90年代以后，研究者們開始從白酒釀造環境中分離篩選具有乳酸降解功能的乳酸菌，直接將其應用于白酒生產過程，考察其對白酒中乳酸及乳酸乙酯的影響，但對菌株的種屬及發酵特性并未做深入研究[20，27]。進入21世紀，部分乳酸降解菌的菌株作為菌劑添加到白酒釀造的曲粉和酒醅中，降低了基酒的乳酸及乳酸乙酯的含量，使酒體的香型風格更加典型[8，28]。此外，大部分菌株還處于實驗室研究階段，未投入生產使用[12，14，18，29]。

4.1 作為曲粉添加劑

大曲為酒之骨，白酒釀造用大曲的主要生產原料為小麥，大曲發酵過程中多種微生物經過馴化和富集，為酒醅發酵提供有益菌，集“物系”、“菌系”和“酶系”于一體，其豐富的微生物種類與酶類及多樣的風味物質，對釀造酒的出酒率及酒體品質都有很重要的影響[30]。宋克偉等[8]將篩選到的乳酸降解菌B001添加到麩曲中，進行正常的清香型基酒生產；與對照組基酒相比，試驗組感官同對照組一致，基酒中乳酸乙酯降低了25%，并且提高了14.6%的乙酸乙酯，起到了增乙降乳的作用，并且在品評上體現了清香型酒爽凈、柔順等特點。

4.2 作為酒醅添加劑

白酒生產是以窖池和酒醅為基礎，依靠微生物、大曲微生物和窖泥微生物在窖池中進行著復雜的物質能量代謝的過程，酒醅在窖池環境中充當著物質循環、能量流動和信息傳遞的“三流運轉”規律的載體[31]。劉復今等[20]將通過紫外誘變得到的乳酸降解菌添加到酒醅中，進行正常的清香型白酒發酵生產，與對照組相比，酒體中的乳酸乙酯含量降低，乙酸乙酯的含量升高，其感官品評結果均比原對照酒好，且試驗酒的清香型風格均較對照酒典型。

4.3 作為窖泥養護劑

窖池都是濃香型白酒生產的主要設備和重要的前提條件。要產好酒，就必須有優質的窖池，而好的窖池其本質在于優質的窖泥，優質的窖泥能賦予濃香型白酒一種特殊的“窖香”[32]。但是，隨著生產次數增加，窖泥會出現老化，老化的窖泥含水量低和透水能力差，并由表及里發展，窖泥內有白色粉末或細長針狀結晶產生，白色粉末為乳酸鈣，而針狀結晶為乳酸亞鐵[33-35]。造成這一結果的主要原因是酒醅酸度過大，造成乳酸積累，乳酸與黃泥中的Ca2+、Fe3+結合形成乳酸鈣、乳酸鐵沉淀，這些沉淀在窖泥中積累，造成窖泥板結。劉樂樂等[32]將能夠降解乳酸合成己酸的酪丁酸梭菌、生孢梭菌和克氏梭菌按照一定比例混合制成功能微生物菌劑，用黃水稀釋液和大曲粉混合制成糊狀窖泥養護劑，酒窖起窖后，把糊狀窖泥養護劑均勻地敷在窖壁和窖底表面能降低窖泥中乳酸積累，有效地避免窖泥板結。

5 展望

從白酒生產環境（大曲、窖泥、酒醅及黃水）中分離篩選得到的乳酸降解菌再添加到白酒生產過程，能夠降低酒體中乳酸及乳酸乙酯含量，改善酒體的品質。由于乳酸降解菌來源于生產環境，這些菌株對白酒生產過程中其他微生物的代謝活動影響很小，具有很好的應用前景。但目前研究者只是從發酵材料中對乳酸降解菌進行分離篩選，對乳酸降解菌的種質資源多樣性、群落結構、代謝調控方面未作系統深入研究。

利用乳酸降解菌制備低乳酸和乳酸乙酯含量的調味酒，可以對高乳酸和乳酸乙酯含量的缺陷酒進行調制，改善原酒的品質。與將乳酸降解菌作為菌劑直接添加到釀酒過程相比，制備調味酒的生產投入更少，成本更低，這必將成為乳酸降解菌應用領域研究的熱點。