凝結芽孢桿菌CNJD增殖發酵工藝優化

丁泓皓，戴慧敏，張熠璇，蔡 俊

（湖北工業大學 工業發酵湖北省協同創新中心 工業微生物湖北省重點實驗室發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）作為一種益生菌，其功能及益生特性日益受到人們廣泛的關注。凝結芽孢桿菌可調節腸道中細菌的生長，改善粘膜屏障功能，并影響腸粘膜和全身免疫系統[1-2]；可通過改變pH值來優化礦物質的吸收；可通過產生消化酶對碳水化合物的消化產生重大影響，并且可以通過降解腸道中的膽固醇來降低膽固醇水平，甚至可以產生維生素等重要的營養物質[3-4]。此外，凝結芽孢桿菌在發酵生長后期可以形成芽孢[5]，抵御胃的酸性環境到達腸道，萌發后有助于碳水化合物和蛋白質的消化[6]；凝結芽孢桿菌能夠促進腸道形成抵御各種病原體的環境，有利于營養物質的消化吸收[7]，并且促進有益細菌的繁殖以及腸內細胞健康所需的短鏈脂肪酸的產生[8]。不同的凝結芽孢桿菌菌株，特性存在差異，如：從土壤中分離出來的凝結芽孢桿菌NRS27，嗜熱且對維生素D有大量需求；從鴨的排泄物中分離出的凝結芽孢桿菌BC07，耐酸耐膽鹽，并且乳酸的產量高達43.2 g/L；從雞排泄物中分離出的凝結芽孢桿菌C-4，具體抑制大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[9-12]等特性。

通過常規發酵方式產生的生物質存在局限性，且隨著市場對益生菌產品的需求量增加，生物質對于制藥、乳制品以及益生菌具有非常重要的價值[13]。因此，需要探究增殖凝結芽孢桿菌的方法以增強生物質的積累[14]。目前，國內外對凝結芽孢桿菌在發酵培養方面有一些報道。GAO S F等[15]使用一定濃度的碳酸鈣、磷酸二氫鈉、蛋氨酸，采用分段式補料批次發酵的方式，對1株畜禽用凝結芽孢桿菌進行發酵培養，活菌數由6.80×109CFU/mL提高到8.30×109CFU/mL；葛風清等[16]利用麩皮和豆粕粉等作為培養基，對凝結芽孢桿菌AHU1366進行液體深層發酵培養，OD600nm值達到19.68；嚴濤等[17]利用糖蜜對凝結芽孢桿菌BC01進行發酵優化，使活菌數最高達到6.7×109CFU/mL。一般的凝結芽孢桿菌耐受性較差，那么優化其產孢能力從而提高其耐受性成為必要條件，AMAHA M等[18]通過調節培養基組分來提高凝結芽孢桿菌芽孢產率的研究時發現，在培養基中加入硫酸錳后，產孢能力提高了3倍，且初始pH在6.0時產芽孢能力最強；路程等[19]利用麩皮水代替蒸餾水對凝結芽孢桿菌T50進行發酵優化，并發現在pH值接近中性時芽孢產率可達到94.3%。上述報道對于凝結芽孢桿菌的活菌數或菌體濃度方面有一定的提升，但菌株的生產能力還有待提高。

因此，本研究以凝結芽孢桿菌CNJD為研究對象，采用單因素及響應面試驗優化該菌株增殖的發酵工藝，旨在有效提高凝結芽孢桿菌CNJD活菌數，為進一步研究提高其芽孢產率奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CNJD：分離自湖北工業大學南區菜市場泡菜腌水，保藏于湖北工業大學微生物制劑團隊。

1.1.2 試劑

蔗糖、木糖、淀粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酵母浸粉、玉米芯粉、小麥麩皮、氯化銨、玉米粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、豆粕、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳、溴甲酚紫：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

初始發酵培養基[20]：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AR1140型電子分析天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；PHS-25 pH計：上海精密科學儀器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；EVOLUTION300型可見光分光光度計：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將斜面保存的凝結芽孢桿菌CNJD接種于YPD培養基，45 ℃、160 r/min條件下振蕩培養24 h。

1.3.2 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發酵條件的優化

將活化的凝結芽孢桿菌CNJD按1%（V/V）的接種量接種于初始發酵培養基中，裝液量為100 mL/300 mL，在45 ℃、160 r/min條件下，依次考察發酵時間（0～24 h）、發酵溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、初始pH值（4、5、6、7、8、9、10）、裝液量（25 mL/250 mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL）、搖床轉速（120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min）對凝結芽孢桿菌活菌數的影響，凝結芽孢桿菌的活菌數采用活菌計數法進行測定[21]。

1.3.3 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發酵培養基的優化

（1）單因素試驗

在發酵條件優化后的初始發酵培養基的基礎上，依次考察碳源種類（蔗糖、木糖、淀粉、玉米芯粉、小麥麩皮、葡萄糖，添加量為20 g/L）及添加量（5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L），氮源種類（氯化銨、蛋白胨、玉米粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、豆粕、胰蛋白胨、酵母浸粉，添加量為10 g/L）對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數的影響。

選取較好的三種氮源，分別兩兩做復合氮源比例優化試驗，比例分別為1∶1、1∶2、2∶1，并考察總添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數的影響。

最后，考察無機鹽種類（磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳，添加量為1.0 g/L）對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數的影響。

（2）Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman設計篩選試驗，以蔗糖、胰蛋白胨、酵母浸粉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸錳為自變量，以活菌數為響應值，篩選出對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數影響較為顯著的因素[22]。

（3）最低添加量試驗

從Plackett-Burman試驗設計中挑選出不顯著性因素，考慮到后期投入生產中成本效益的最大化，研究對凝結芽孢桿菌活菌數影響不顯著的因素的最低添加量。

（4）最陡爬坡試驗

從Plackett-Burman設計試驗中挑選出顯著性因素進行最陡爬坡試驗，依據顯著性因素正負效應，設計合理的步長，增加試驗的密集度，來逼近效果最好的區域[23]。

（5）中心組合設計試驗

根據最陡爬坡試驗結果，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數試驗數據進行方差分析及多元回歸方程擬合，依據回歸方程繪制響應面圖，并預測發酵培養基的最佳組成[24]。

1.3.4 數據統計分析

應用Design-Expert 8.0.6.1進行數據處理和分析，包括回歸分析、二次多項式回歸方程、方差分析和響應面圖。所有試驗重復3次，實驗數據表示為“平均值±標準偏差”。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發酵條件的優化

不同發酵條件對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖1。

圖1 不同發酵條件對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on the viable number of Bacillus coagulans CNJD

由圖1a可知，發酵0～4 h為菌體生長的遲緩期，4～16 h為對數生長期，16～24 h為穩定期，16 h活菌數最高為（1.48±0.11）×1010CFU/mL，故確定最優發酵時間為16 h。

由圖1b可知，隨著發酵溫度的升高，菌體活菌數呈先升高后下降的趨勢，當發酵溫度為55 ℃時，活菌數最高為（2.78±0.13）×1010CFU/mL，故確定最優發酵溫度為55 ℃。

由圖1c可知，當接種量逐漸增大時，菌體活菌數并無明顯變化，考慮到后期利用發酵罐高密度發酵菌體，接種量過大在操作接種這一步驟時可能會提高染菌幾率，故確定最優接種量為2%。

由圖1d可知，隨著初始發酵pH值的升高，菌體活菌數呈先升高后下降的趨勢，當初始發酵pH值為5.0時，菌體生長最好，活菌數最高為（3.98±0.14）×1010CFU/mL，故確定最優初始發酵pH值為5.0。

由圖1e可知，隨著裝液量的增大，菌體活菌數呈先升高后下降的趨勢，當裝液量為50 mL/250 mL時，菌體生長最好，活菌數最高為（4.67±0.17）×1010CFU/mL，表明此時搖瓶中的溶氧最適合該菌體生長，故確定最優裝液量為50 mL/250 mL。

由圖1f可知，隨著轉速的升高，菌體活菌數呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是，在發酵過程中，搖瓶轉速影響菌體發酵過程中的溶氧，若是轉速太高，溶氧增大，則容易抑制凝結芽孢桿菌這種兼性厭氧菌的生長，若轉速太低，會影響菌體的二分裂，從而導致菌體生長遲緩。當搖瓶轉速為180 r/min時，菌體生長最好，活菌數最高為（5.37±0.15）×1010CFU/mL，故確定最優搖瓶轉速為180 r/min。

2.2 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發酵培養基的優化

2.2.1 碳源種類及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響

碳源種類及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖2。

圖2 碳源種類（a）及蔗糖添加量（b）對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.2 Effect of carbon source types (a) and sucrose addition (b) on the growth of Bacillus coagulans CNJD

由圖2a可知，當蔗糖作為發酵培養基的碳源時，活菌數最高，為（6.45±0.12）×1010CFU/mL。分析原因可能是等體積的蔗糖作為碳源相較于葡萄糖來說，更容易在菌體發酵時提供一個低滲透壓的環境[25]，故確定最佳碳源為蔗糖。

由圖2b可知，當蔗糖添加量為30 g/L時，活菌數最高，為（6.93±0.16）×1010CFU/mL。當蔗糖的添加量較少時，由于培養基中營養物質的缺乏，導致菌體生長受限；而當蔗糖的添加量過多時，培養基的粘度上升，造成培養基中溶氧的不足，從而導致菌體的生長受到抑制[26]，故確定最佳蔗糖添加量為30 g/L。

2.2.2 氮源種類及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響

氮源種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖3。

圖3 氮源種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on the growth of Bacillus coagulans CNJD

無機氮源對于微生物生長來說吸收較快，但在發酵過程中無機氮源會影響培養基中的pH值；相較于無機氮源，有機氮源含有大量的無機鹽及生長因子，并且含有豐富的微量元素[27]，由圖3可知，當氮源為酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨、豆粕時，活菌數較高，又考慮到豆粕為工業副產品，出于生產成本以及資源再利用角度考量，使用豆粕代替活菌數較高的蛋白胨來進行復合氮源優化。因此選用酵母浸粉、胰蛋白胨和豆粕作為復合氮源。復合氮源比例及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響分別見表1和圖4。

圖4 復合氮源添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.4 Effect of compound nitrogen source addition on the growth of Bacillus coagulans CNJD

表1 復合氮源比例對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Table 1 Effect of compound nitrogen source ratio on the growth of Bacillus coagulans CNJD

由表1可知，氮源的復合使用對于微生物生長起到了一定的促進作用，當胰蛋白胨∶酵母浸粉=1∶1時，菌株的活菌數最高，為（7.13±0.15）×1010CFU/mL，故選用胰蛋白胨∶酵母浸粉=1∶1作為復合氮源。

由圖4可知，隨著復合氮源添加量的增多，活菌數也不斷增加，當添加量為25 g/L時，活菌數最高，為（7.35±0.15）×1010CFU/mL，故確定最優氮源添加量為25 g/L。

2.2.3 無機鹽種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響

無機鹽種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖5。

圖5 無機鹽種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.5 Effect of inorganic salt type on the growth of Bacillus coagulans CNJD

由圖5可知，磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣和硫酸錳這幾種單一無機鹽，對凝結芽孢桿菌CNJD的生長具有積極影響，故選擇磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣和硫酸錳進行后續的PB試驗。

2.2.4 Plackett-Burman試驗設計

通過對單因素試驗結果分析，確定了PB試驗的因素，然后通過PB試驗篩選得到對凝結芽孢桿菌活菌數有顯著性影響的組分，以便對培養基的組分進行進一步的優化。按照Design-Expert 8.0.6.1軟件設計PB試驗，試驗次數12次，每組3個平行，PB試驗設計及結果見表2，試驗方差及主效應分析見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗方差及主效應分析Table 3 Variance and main effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表3可知，回歸模型的P值＜0.05，顯著。蔗糖、氯化鈣、硫酸錳對凝結芽孢桿菌CNJD的活菌數影響顯著（P＜0.05），且其中蔗糖、氯化鈣為正效應，硫酸錳為負效應，而其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。由表4的方差分析可知，決定系數R2=0.907 4，表明90.74%的數據都能用此模型來解釋。

2.2.5 最低添加量試驗

根據Plackett-Burman設計試驗得到的影響菌株活菌數的不顯著因素，即磷酸氫二鉀、氯化鈉、胰蛋白胨、酵母浸粉，做最低添加量試驗，結果見表4。

表4 不顯著因素的最低添加量試驗Table 4 Minimum addition experiments of insignificant factors

在發酵生產過程中，經濟效益、產品成本是首要考慮因素，所以為了極大程度的減少成本，選擇每個因素下活菌數最高的添加量作為最低添加量，即磷酸氫二鉀0 g/L、氯化鈉1.50 g/L、胰蛋白胨10.00 g/L、酵母浸粉10.00 g/L。

2.2.6 最陡爬坡試驗

固定酵母浸粉10.00 g/L，氯化鈉1.50 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，根據Plackett-Burman試驗結果，選取影響顯著的因素蔗糖（A）、氯化鈣（B）、硫酸錳（C）為考察因素，活菌數（Y）為響應值，按照各因素的正負效應設定最陡爬坡試驗。

由表5可知，當蔗糖、氯化鈣和硫酸錳的添加量分別為45.00 g/L、1.60 g/L和0.40 g/L時，凝結芽孢桿菌的活菌數最高，為（7.53±0.16）×1010CFU/mL，因此將其作為中心復合試驗的中心點，進一步優化組分的添加量。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest climb experiments

2.2.7 中心組合設計試驗

通過最陡爬坡試驗得到的中心點：蔗糖45.00 g/L、氯化鈣1.60 g/L、硫酸錳0.40 g/L，以此為中心點，固定酵母浸粉10.00 g/L，氯化鈉1.50 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，以活菌數為響應值進行3因素5水平的中心復合設計試驗，試驗設計及結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 中心復合設計試驗結果Table 6 Results of center composite design experiments

表7 響應面試驗的方差分析結果Table 7 Variance analysis results of response surface experiments

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表6試驗數據進行二次多項回歸擬合，得到的模型方程為Y=-39.529 08+1.501 12A+9.411 82B+58.491 05C-0.293 75AB-0.517 5AC-25.937 5BC-0.010416A2+3.256 64B2-2.176 24C2。由表7可知，模型的P值＜0.05，顯著；失擬項的P值＞0.05，不顯著，說明該模型與試驗值擬合較好，可用于活菌數的預測。決定系數R2=0.779 5，表明預測有22.05%的變異情況不能由該模型解釋。方程中一次項B、交互項BC對活菌數影響顯著（P＜0.05），一次項C對活菌數影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。其中氯化鈣與硫酸錳交互作用對活菌數影響的響應面及等高線圖見圖6。

圖6 氯化鈣與硫酸錳的交互作用對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between CaCl2 and MgSO4 on the viable number of Bacillus coagulans CNJD

由圖6可知，氯化鈣與硫酸錳的交互作用對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數影響的響應面有最高點，且等高線呈橢圓，說明兩因素間交互作用明顯，與方差分析結果一致。

由模型和軟件分析得到凝結芽孢桿菌CNJD的最優培養基組成為蔗糖48.59 g/L，氯化鈣1.70 g/L，硫酸錳0.33 g/L，活菌數預測值為7.99×1010CFU/mL，在此優化條件下進行3次重復試驗，活菌數為（7.86±0.25）×1010CFU/mL。實測值與回歸方程預測值吻合良好。

3 結論

本研究以活菌數為評價指標，采用單因素試驗得到凝結芽孢桿菌CNJD增殖的最優培養條件為：接種量2%、初始發酵pH值5.0、培養溫度55 ℃、搖床轉速180 r/min、發酵時間16 h、裝液量50 mL/250 mL。在此基礎上，采用單因素試驗及響應面試驗優化得到最優培養基組成為：蔗糖48.59 g/L，酵母浸粉10.00 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，氯化鈣1.70 g/L，硫酸錳0.33 g/L，氯化鈉1.50 g/L。在此優化條件下，凝結芽孢桿菌的活菌數為（7.86±0.25）×1010CFU/mL。