浩乳德用直投式發酵劑保護劑配方優化及應用

景安琪，張鳳梅，孫立山，吳 楠，雙 全

（1.內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.正藍旗長虹乳制品廠，內蒙古 錫林郭勒盟 027200）

隨著人們生活水平的不斷提高，各種乳及乳制品開始被大眾選擇，經過30多年的不懈努力，我國已成為世界第三大產奶國[1]，在國家政策的扶持下，我國在自制乳制品方面大有突破[2]，但在傳統乳制品這一方面，我國大部分企業仍需依靠購買進口發酵劑才能進行生產，存在著生產成本高、生產速率低、價位高等問題，因此自主研發相關直投式發酵劑成為了至關重要的一環。主流的直投式發酵劑通常采用真空冷凍干燥法、噴霧干燥法等[3]生產方式，由于噴霧干燥過程中熱空氣對乳酸菌的致死效應導致干燥后乳酸菌的存活率較低，因而真空冷凍干燥法最為常用，具有避免熱敏感產品的高溫加工，降低產品因熱不穩定而造成的損失[4]等優勢，而且冷凍干燥過程中向菌懸液中添加凍干保護劑，可以有效防止外界壓力對細胞膜磷脂雙分子層的破壞，從而減少低溫、高壓等物理或化學傷害[5-6]，提高乳酸菌的存活率。

近年來，很多學者對發酵劑保護劑進行了研究，ZHANG J等[7]以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei-Zhang）為研究對象，根據細胞存活率和生理特性，研究了不同凍融保護劑的凍融效果。結果表明，添加谷胱甘肽作為理想的低溫保護劑，可顯著提高存活率達86.6%。GUL L B等[8]以短乳桿菌ED25為研究對象，采用Box-Behnken試驗設計優化凍干保護劑，得到最佳保護劑由脫脂乳（17.28%）、乳糖（2.12%）和蔗糖（10%）組成，凍干后對細胞活力的保護率＞99%。柏旭[9]在制備干酪乳桿菌直投式發酵劑（Directed-Vat-Set，DVS）時，對生理鹽水、蔗糖、乳糖、半乳糖、脫脂乳粉、甘油、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、海藻糖和谷氨酸鈉11種凍干保護劑進行研究，最終確定海藻糖（49.20%）和谷氨酸鈉（50.80%）復合凍干保護劑能夠使干酪乳桿菌凍干存活率從不到10%提升至65.07%。忻勝兵[10]對適于冰葡萄酒生產的復合直投式發酵菌劑工藝進行研究，以耐糖酵母CX13和產酯酵母K2"-27為研究對象，確定復合凍干劑最優保護劑配方為將海藻糖（7%）、蔗糖（7%）、甘油（4%）、谷氨酸鈉（2%）以及脫脂乳（5%）混合，存活率可達85.33%。劉剛等[11]在單因素試驗基礎上，選用正交試驗優化嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）Q4F8保護劑的工藝條件，得到最優保護劑配方為脫脂乳120 g/L、谷氨酸鈉10 g/L、甘油60 g/L和海藻糖80 g/L，此條件下存活率達90.08%。

浩乳德又稱為奶豆腐、奶酪，是以生鮮乳為原料，經凈乳、發酵、部分脫脂、加熱、排乳清、凝乳塊乳化、裝模成型等蒙古族傳統工藝制成的奶制品[12-13]，浩乳德中蛋白質含量高，其中酪蛋白是主要蛋白質，其氨基酸比例平衡，必需氨基酸含量較高，是一種優質蛋白質，消化率接近100%，因此，奶豆腐是人體補充優質蛋白質的良好來源[14]。本試驗前期從傳統浩乳德發酵乳中分離純化出一株優勢菌株，編號為686，經16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。為制備菌株686直投試發酵劑，本研究通過單因素試驗篩選保護劑成分，以凍干存活率為目標，結合Box-Behnken響應面分析法，選擇出最優保護劑配比方案。此外，采用菌株686直投試發酵劑制備浩乳德，并對其進行理化指標及掃描電鏡分析，對其保護機制進行探討，為生產改進型奶酪用直投式發酵劑的規模化、標準化生產提供理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

鮮牛乳（水分87.5%、蛋白質3.6%、脂肪3.5%、碳水化合物4.8%）：內蒙古正藍旗長虹乳制品廠提供；脫脂乳粉（蛋白質34%、脂肪1%、碳水化合物53.3%）：北京酷來搏科技有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）686：分離自內蒙古正藍旗長虹乳制品廠浩乳德（奶豆腐）發酵乳。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖（分析純）：天津福晨化學試劑廠；菊粉：河南萬邦實業有限公司；海藻糖、谷氨酸鈉、谷胱甘肽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉（分析純）：北京化工廠；甘油（分析純）：天津科貿化學試劑有限公司；山梨醇（分析純）：美國Sigma公司；凝乳酶（40 000 U/g）：澳大利亞Clerici Spa公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯、MRS固體培養基：廣東環凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ESR-500型高剪切分散乳化機：上海易勒機電設備有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；BSA223S-CW電子分析天平：德國Sartorius公司；FDU-2200真空冷凍干燥機：日本Eyela公司；DW-86L728J超低溫保存箱：海爾集團；SX-500全自動高壓滅菌鍋：日本TomyDigitalBiology公司；XL30掃描電子顯微鏡：荷蘭Philips公司；K9860全自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；SA 402B電子舌：日本Insent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 浩乳德加工工藝流程及操作要點

操作要點：

均質：為防止殺菌過程中脂肪上浮，將新鮮牛乳放入潔凈的均質機中，在60～65 ℃、20 MPa條件下均質30 min。

殺菌：均質后將牛乳放入80 ℃的水浴鍋中加熱15 min進行巴氏殺菌，迅速冷卻至37 ℃。

接種：菌株686在MRS肉湯中活化2代后，按照2%的接種量加入巴氏殺菌后的牛乳中，發酵至凝乳，制作成母發酵液。將母液按照10%的接種量加入牛乳中進行發酵，控制發酵溫度為37～38 ℃，每隔20 min取樣，測定其酸度。

凝乳酶進行活化：稱取2 g食品級NaCl，用蒸餾水定容至100mL容量瓶中制成質量濃度為20g/L的鹽水，滅菌（121℃、15 min）后放入37 ℃水浴鍋，以0.04 g/kg計算稱取凝乳酶的添加量，將稱取的凝乳酶倒入小燒杯中，以凝乳酶∶鹽水=1∶50固液比（g∶mL）量取預熱好的鹽水并倒入盛放凝乳酶的燒杯中進行活化，活化30 min備用。

凝乳酶凝乳：待牛乳發酵酸度達到22～23°T，加入活化后的凝乳酶，迅速攪拌1 min并將發酵溫度調至42 ℃，靜置發酵凝乳40 min。

切割：凝乳塊達適當硬度時，用食指斜向插入凝塊中約3 cm，當手指向上抬起時，如裂紋整齊，指上無小片凝塊殘留且乳清透明時，即可開始進行切割。將凝塊切成1 cm3的小方塊，在原溫度下保持10 min。

排乳清：當乳清大量析出時，乳清分兩次排除，第一次排除50%，攪拌5 min，然后排除所有乳清。將干酪粒堆釀，堆釀期間每隔10 min將凝塊上下翻轉。

堆釀、加鹽：將堆釀后的凝塊切碎，加入原乳3%的食鹽，攪拌均勻。

熱燙、拉伸：將浩乳德粒裝入容器中，加入85 ℃左右水，反復揉捏并拉伸折疊，凝塊可拉成絲狀即可。

冷卻、包裝：將浩乳德裝入模具中，放入5～10 ℃的高濃度（20%）鹽水中使其硬化，30 min后取出，進行真空包裝，得到浩乳德成品。

1.3.2 菌株培養及凍干菌粉的制備

將保藏的菌株686活化，按照3%的接種量接種到MRS肉湯培養基中，37 ℃恒溫厭氧培養24 h后，在5 500 r/min條件下離心15 min，用0.85%的生理鹽水沖洗兩次后，去除上清液，得到菌泥，參考陳合等[15]的配比方法，加入與菌泥體積比為2∶1的保護劑，混勻后，于-80 ℃條件下預冷凍12 h后，真空冷凍干燥24 h，得到凍干菌粉。

1.3.3 凍干存活率

將凍干后的乳酸菌粉加入與凍干前等體積的生理鹽水（濃度為0.85%）進行復水，按照稀釋涂布平板法接入MRS固體培養基中，37 ℃恒溫厭氧培養48 h，用平板計數法計數，每組做3個平行。凍干存活率計算公式如下[16]：

式中：a為凍干存活率，%；m1為凍干前活菌數，CFU/mL；m2為凍干后活菌數，CFU/mL。

1.3.4 保護劑配方優化單因素試驗[5，17]

經查閱大量相關文獻，將凍干保護劑分為多元醇類、糖類、氨基酸類、蛋白質/肽類和聚合物類這五大類，本試驗選擇了多元醇類：甘油、山梨醇；糖類：葡萄糖、菊粉、海藻糖；氨基酸類：谷氨酸鈉；蛋白質/肽類：脫脂乳和谷胱甘肽，這8種作為凍干保護劑進行研究，添加量分別為3 g/100 mL、6g/100mL、9g/100mL、12g/100mL、15g/100mL、18g/100mL、21 g/100 mL、24 g/100 mL，分別考察各因素對凍干菌株存活率的影響。

1.3.5 響應面法優化保護劑配方

根據單因素的試驗結果，選擇脫脂乳（A）、海藻糖（B）、谷氨酸鈉（C）為3個影響因素，顯著中心為零水平，高水平和低水平比零水平高或者低1/2個原始實際步長[18]，用Box-Behnken法優化設計試驗，以凍干存活率（Y）為響應值來確定最佳凍干保護劑的配比研究，響應面試驗因素與水平如表1所示。

表1 保護劑配方優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for protective agent formulation optimization

1.3.6 掃描電鏡觀測凍干菌體形態特征

以添加最優保護劑的凍干菌粉686為試驗組，以生理鹽水（0.85%）為保護劑的乳酸菌686為空白對照組，用XL30型掃描電子顯微鏡進行不同放大倍數微觀結構的觀察。

1.3.7 改進式浩乳德品質測定

用最優保護劑凍干的菌粉686用無菌0.85%的生理鹽水復水，以3%的接種量接入脫脂乳中，按照1.3.2中工藝流程制作改進式浩乳德，以長虹乳制品廠生產的傳統浩乳德為對照組，根據國標GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[19]、GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[20]、GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[21]及GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[22]中規定方法測定水分、蛋白質、脂肪及灰分，用電子舌對滋味進行測定。

1.3.8 數據處理

試驗數據采用Excel 2016、SPSS 22.0進行處理分析，用Origin 8.5進行圖片處理制作，用Design-Expert 11.0.3進行響應面模型擬合并分析。

2 結果與分析

2.1 保護劑配方優化單因素試驗

由圖1可知，保護劑為脫脂乳、海藻糖及谷氨酸鈉時，凍干存活率顯著高于其他組（P＜0.05），當保護劑為12.0 g/100 mL脫脂乳時出現峰值（79.08%）；在谷氨酸鈉質量濃度為15.0 g/100 mL時，菌株686出現最高存活率（76.78%）。脫脂乳的積極作用可以歸因于其提供涂層的能力，在冷凍干燥過程中保護微生物細胞的膜[4]；谷氨酸鈉的保護機制被認為是保護劑中的氨基與細菌蛋白質的羧基之間反應的結果，從而穩定了蛋白質的結構[23]；大量試驗研究發現乳酸菌在海藻糖中存活率較高，是較優質的凍干保護劑，并經研究發現海藻糖能和細胞膜中的某些成分形成氫鍵作用，取代水的位置，保護細胞膜的穩定性[24-25]，提高乳酸菌的存活率，通過試驗研究發現，當海藻糖質量濃度為6.0 g/100 mL和18.0g/100 mL時，存活率出現兩次峰值（74.69%和77.76%），但考慮到實際應用及成本費用等因素，盡量選擇低成本、高效率的保護劑。因此，本試驗選擇脫脂乳12.0 g/100 mL、海藻糖6.0 g/100 mL、谷氨酸鈉15.0 g/100 mL三種凍干保護劑進行響應面試驗。

圖1 不同保護劑對菌株686凍干存活率的影響Fig.1 Effect of different protective agent on freeze-drying survival rates of strain 686

2.2 凍干保護劑配方優化響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，以脫脂乳（A）、海藻糖（B）和谷氨酸鈉（C）添加量為自變量，以凍干存活率（Y）為響應值，利用Design-Expert 11.0.3軟件對表2數據進行方差分析，結果見表4。經回歸擬合后得到菌株686凍干存活率的回歸方程如下：

表2 保護劑配方優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for protective agent formulation optimization

由表3可知，模型P＜0.000 1，說明回歸模型極顯著，且失擬項P值＞0.05，證明試驗誤差較小，可以用該模型對試驗結果進行分析[26]。一次項A、C，交互項AB，二次項A2、B2和C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B對結果影響顯著（P＜0.05）。比較F值可知，對菌株686凍干存活率影響順序為A脫脂乳＞C谷氨酸鈉＞B海藻糖。

響應面圖和等高線圖可以反映兩因素之間的交互作用，響應面越陡峭說明兩自變量間的交互作用對響應值影響程度越大，相反，則不顯著，同時等高線越接近橢圓，兩因素的交互作用越顯著，越接近圓形則交互作用越不顯著[27-29]。

固定谷氨酸鈉為零水平，脫脂乳和海藻糖對凍干存活率的影響的響應面及等高線見圖2。由圖2可知，因素AB響應面曲面陡峭，等高線接近橢圓，因此因素AB之間是有顯著的交互作用（P＜0.05）；當脫脂乳為低濃度時，存活率隨著海藻糖濃度增加呈先上升至某一值后緩慢下降的趨勢，這可能是由于高濃度的保護劑可以加速細胞內的蛋白質聚合，形成較強的玻璃化結構，反而不利于細胞的保存，且復水效果不好[30]；將海藻糖濃度固定時，存活率隨著脫脂乳濃度增加呈迅速上升至某一值后緩慢下降的趨勢。且通過響應面圖形可看出，脫脂乳上升幅度比海藻糖陡峭，說明脫脂乳對存活率的影響更大，這與方差分析結果一致。

圖2 脫脂乳和海藻糖交互作用對菌株686凍干存活率影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interactions between degreased milk and trehalose on freeze-drying survival rates of strain 686

2.3 驗證試驗

根據建立模型進行參數優化分析[31]，以凍干存活率最高值為優化目標，得到菌株686的最佳保護劑配方為脫脂乳添加量12.348 g/100 mL，海藻糖添加量5.963 g/100 mL，谷氨酸鈉添加量14.485 g/100 mL，在此優化配方條件下，菌株686凍干存活率理論值為80.90%。為了便于實際操作，將上述優化配方條件修正為脫脂乳添加量12.5 g/100 mL，海藻糖添加量6.0 g/100 mL，谷氨酸鈉添加量14.5 g/100 mL。在此優化配方條件下，進行3次驗證試驗，菌株686凍干存活率實際值為81.59%，與預測值基本吻合，說明本次試驗模型是可行的。

2.4 掃描電鏡觀測凍干菌體形態特征

為觀察添加保護劑前后的凍干狀態，對植物乳桿菌686凍干菌粉進行掃描電鏡測定，結果見圖3。

圖3 凍干菌株686凍干菌粉的掃描電鏡結果Fig.3 Scanning electron microscope results of freeze-drying powder of strain 686

由圖3可知，未添加保護劑的菌體均暴露于表面，完整性差，極易受到各種物理及化學損傷，有些菌體已經變型甚至破裂，菌體之間有拉絲狀物質，因而存活率低。加入保護劑的樣品在凍干后介質呈現出多孔疏松的結構，更利于迅速復水及速溶的特性。并且添加保護劑組幾乎看不到菌體，菌體被完整的包埋于保護劑中，從而避免受到外界傷害，提高了乳酸菌的存活率，這與蘇萍等[32-33]的研究結果相似。

2.5 改進浩乳德品質特性

由圖4可知，將對試驗組及對照組進行獨立樣本T檢驗，試驗組與對照組浩乳德水分分別為50.28%和52.36%，無顯著差異（P＞0.05）；試驗組蛋白質含量25.16%，高度顯著高于對照組（P＜0.001），說明在制作浩乳德過程中，排出乳清較為清澈，蛋白質流失較少；試驗組的脂肪含量為20.8%，對照組為19.8%，極顯著高于對照組（P＜0.01）；試驗組與對照組分含量分別為3.32%和3.19%，試驗組顯著高于對照組（P＜0.05），可能是由于試驗組水分含量比對照組低，因此灰分含量上升。

圖4 改進前后浩乳德理化指標Fig.4 Physicochemical indexes of Haorude before and after improvement

本試驗采用電子舌系統檢測兩組浩乳德的6種基本滋味和3種回味，試驗組與對照組具有相似滋味得分輪廓，差異很小，無法看出二者的區別。因此進一步進行獨立樣本T檢驗，改進前后各滋味指標得分及差異性分析結果見表4。

表4 改進前后浩乳德各滋味指標及差異性分析Table 4 Taste indexes and difference analysis of Haorude before and after improvement

由表4可知，試驗組與對照組在酸味、苦味、澀味、回味-A及回味-B無顯著差異（P＞0.05），說明試驗組與對照組均無不良風味，而試驗組在咸味及甜味與對照組有顯著差異（P＜0.01），可能是由于試驗組在浸泡完鹽水后，立即取出進行測試，表面鹽水濃度過高，導致咸味值高，后續可通過工藝優化來解決此問題；試驗組的鮮味值顯著高于對照組（P＜0.05），可能是因為添加了發酵乳酸菌液，乳酸菌將大分子的蛋白質分解，產生各種游離氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸等），因此鮮味有所提高[34]，同理，試驗組的豐富度也高度顯著高于對照組（P＜0.001）。

直投式發酵劑發酵的浩乳德在滋味方面與市售浩乳德相似，脂肪、蛋白質、灰分的含量優于市售傳統浩乳德，可對直投式發酵劑替代傳統浩乳德生產進行更深入的研究。

3 結論

本研究以菌株686的凍干存活率為指標，通過單因素試驗及響應面分析法確定了保護劑最佳配方為脫脂乳12.5 g/100 mL，海藻糖6.0g/100 mL，谷氨酸鈉14.5 g/100 mL。在此優化條件下，菌株686的凍干存活率為81.59%。掃描電鏡結果表明優化的保護劑對穩定乳酸菌686菌體形態起到良好的保護作用，對微生物細胞膜也有較好的保護效果。將直投式發酵劑用于改進式浩乳德后測得水分、蛋白質、脂肪及灰分分別為50.28%、25.16%、22.8%及3.76%，與市售浩乳德相比有所提高；電子舌測得改進式浩乳德與市售浩乳德得分輪廓相似，在鮮味及豐富度優于市售浩乳德。

結果表明，此配方凍干保護劑有效的提高了乳酸菌的存活率，且直投式發酵劑制作浩乳德在滋味方面基本無差異，理化指標顯著優于市售浩乳德，為后續高效率且低成本的優質浩乳德開發奠定了基礎。