響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果酒發(fā)酵工藝研究

王 宏，李 登，黃星源，劉功良 *，白衛(wèi)東，曾 彬

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東星耀生物科技有限公司，廣東 郁南 527100；3.天地壹號(hào)飲料股份有限公司，廣東 江門(mén) 529000）

刺梨（Rosa roxburghii）是薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，生長(zhǎng)在海拔500 m到2 500 m的地區(qū)，分布于陜西、甘肅及西南等地區(qū)，其中貴州所產(chǎn)刺梨最為出名[1]。刺梨果肉爽脆，成熟后的刺梨肉質(zhì)肥厚、味酸甜。刺梨富含維生素C、超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、胡蘿卜素、有機(jī)酸等十多種人體所需的微量元素[2]。此外，刺梨果實(shí)中還含有很多重要生物活性成分，目前從刺梨中分離得到的活性物質(zhì)包括：原兒茶酸、刺梨酸、刺梨苷等，分別是黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、三萜類(lèi)化合物[3-4]。

刺梨清甜爽口，具有獨(dú)特的香氣，同時(shí)還富含多種人體所需營(yíng)養(yǎng)成分，具有延緩衰老[5]、提高機(jī)體免疫作用[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、預(yù)防癌癥[9]、解毒[10]等多種功效，因此，對(duì)刺梨進(jìn)行研究與利用具有廣闊的市場(chǎng)需求和前景。刺梨除了鮮食之外，還能曬干泡水，加工成方便食用與存放的相關(guān)產(chǎn)品。其中果酒不僅能夠保留果實(shí)中原有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相比蒸餾酒具有更加高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)微循環(huán)等生理保健作用[11]。韋唯等[12-15]比較了刺梨鮮果、無(wú)籽刺梨和金刺梨不同加工方式對(duì)果酒品質(zhì)及其相關(guān)成分的影響，為刺梨果果實(shí)深加工開(kāi)發(fā)提供了新思路。

由于刺梨果實(shí)的收獲期不足30 d，鮮果供應(yīng)期短，會(huì)在一定程度上限制刺梨果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及市場(chǎng)的擴(kuò)大。刺梨加工成刺梨果干后更有利于貯藏及運(yùn)輸。本研究探討了初始糖含量、酵母接種量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)刺梨果酒品質(zhì)的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了刺梨果酒發(fā)酵工藝，以期為刺梨果酒生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果干：成都暖民投資管理有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（食品級(jí)，酶活力30 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；纖維素酶（食品級(jí)，酶活力10 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH4電熱恒溫水浴鍋：邦西儀器科技有限公司；BL-600電子天平：廣州市正一有限公司；DHP-9172電熱恒溫培養(yǎng)箱：廣州康恒儀器有限公司；6202高速粉碎機(jī)：常州澳華儀器有限公司；722可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 刺梨果酒發(fā)酵工藝流程刺梨果干→粉碎→酶解→過(guò)濾→糖酸調(diào)整→接種→發(fā)酵→過(guò)濾→殺菌→果酒樣品

1.3.2 主要操作要點(diǎn)

（1）粉碎：將刺梨果干置于高速粉碎機(jī)中粉碎，備用。

（2）酶解：向刺梨果粉中加入適量無(wú)菌水，攪拌均勻。為加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸，再加入0.05%的果膠酶與0.1%纖維素酶，50 ℃酶解40 min[16-17]，過(guò)濾。

（3）糖酸調(diào)整：向果汁中加入適量白砂糖，并調(diào)整pH為4.0[18-19]。

（4）接種：稱(chēng)取適量的安琪活性干酵母BV818，加入10倍含4%葡萄糖的無(wú)菌水溶液中，混勻，于35 ℃保溫20～30 min，期間每10 min振蕩一次，至產(chǎn)生大量氣泡即可[20]。

（6）發(fā)酵：接入適量的擴(kuò)大培養(yǎng)后的酵母菌，蓋上6層紗布于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酒精發(fā)酵，待酒液上泡沫下降（約1.5 d）即可換上玻璃塞，進(jìn)行發(fā)酵。

（7）殺菌：將樣品置于70 ℃加熱20 min[21]。

1.3.3 刺梨果酒感官評(píng)價(jià)分析

根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]中有關(guān)葡萄酒、果酒的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及其他研究中對(duì)刺梨果酒或其他果酒[23]的感官描述，對(duì)刺梨果酒的色澤、外觀、香氣、滋味及典型性各項(xiàng)影響的大小，從而得出刺梨果酒感官評(píng)價(jià)表如表1，滿分100分。選取具有一定果酒品嘗能力的10人，通過(guò)感官評(píng)價(jià)對(duì)刺梨果酒各項(xiàng)進(jìn)行評(píng)分。

表1 刺梨果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of Rosa roxburghii fruit wine

續(xù)表

1.3.4 刺梨果酒酒精度的測(cè)定

根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的酒精計(jì)法測(cè)定[22]。

1.3.5 刺梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用刺梨果粉添加量為7.5%制得刺梨果汁，分別考察不同初始糖含量（200 g/L、240 g/L、280 g/L、320 g/L、360 g/L）、酵母接種量（4%、5%、6%、7%、8%）、發(fā)酵時(shí)間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對(duì)發(fā)酵果酒感官評(píng)價(jià)及酒精度的影響。

1.3.6 刺梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以初始糖含量（A）、酵母添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為評(píng)價(jià)因素，以感官評(píng)分（Y）作為響應(yīng)值，通過(guò)建立回歸方程預(yù)測(cè)響應(yīng)值最大時(shí)確認(rèn)刺梨果酒的釀造工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 刺梨果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for Rosa roxburghii fruit wine fermentation conditions optimization

1.3.7 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其顯著性差異分析采用Design-Expert 8.0.6軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始糖含量對(duì)刺梨果酒品質(zhì)的影響

如圖1所示，隨著初始糖含量增加，刺梨果酒逐漸澄清，酒香逐漸濃郁，口感越來(lái)越甜。從感官評(píng)價(jià)這一指標(biāo)來(lái)看，初始糖含量在240 g/L時(shí)，分值達(dá)到最高。隨著發(fā)酵初始糖含量增大，酒精度逐漸增大。初始糖度對(duì)刺梨果酒酒精度和感官評(píng)價(jià)影響的變化趨勢(shì)同柚子果酒工藝報(bào)道類(lèi)似[24]。同時(shí)，當(dāng)發(fā)酵初始糖含量較高時(shí)，發(fā)酵液的滲透壓增大，抑制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖。酵母菌的生長(zhǎng)適應(yīng)期延長(zhǎng)時(shí)，對(duì)刺梨果酒的酒精發(fā)酵而言是不利的，酒精度難以上升。而且初始糖含量太高意味著調(diào)整糖度時(shí)所添加的白砂糖量增多，發(fā)酵后酒的果香也會(huì)受到影響，同時(shí)果酒太甜也會(huì)影響刺梨果酒的口感及風(fēng)味。綜上，刺梨果酒的發(fā)酵初始糖含量應(yīng)該選擇在240 g/L左右。

圖1 初始糖含量對(duì)刺梨果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.1 Effect of initial sugar concentration on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine

2.1.2 酵母接種量對(duì)刺梨果酒品質(zhì)的影響

如圖2所示，酒精度總體上隨著酵母接種量的增加而緩慢上升。酵母菌含量增加，其生長(zhǎng)繁殖速度加快，無(wú)氧呼吸產(chǎn)物酒精增多，消耗的糖也增多。當(dāng)酵母接種量過(guò)多時(shí)，發(fā)酵果汁中的酵母菌濃度高，酵母數(shù)量不斷增加，酵母菌所產(chǎn)生的代謝廢物也所增加，此時(shí)酵母活性降低，影響果酒質(zhì)量。同時(shí)刺梨果酒隨著酵母接種量的增加，果酒的色澤由黃棕色逐漸變淺，但沉淀及懸浮物逐漸增多，酒香雖逐漸增加，但“酵母味”也相應(yīng)增加[25]，刺梨原有的果香味逐漸被掩蓋。果酒口感略微下降，苦澀味變重，感官評(píng)價(jià)得分呈下降趨勢(shì)。優(yōu)先考慮到刺梨果酒感官評(píng)分結(jié)果，因此酵母接種量選擇在4%左右。

圖2 酵母接種量對(duì)刺梨果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)刺梨果酒品質(zhì)的影響

如圖3所示，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，刺梨果酒酒精度不斷增加。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＜7 d時(shí)，刺梨果酒隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，口感愈加醇厚、細(xì)膩，酒香愈加濃郁、醇和，果酒獨(dú)特的風(fēng)味更加協(xié)調(diào)、酸甜適中，感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間的增加不斷升高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，刺梨果酒的感官指標(biāo)均處于較高水平。發(fā)酵時(shí)間＞7 d之后，刺梨果酒酒體逐漸渾濁，酒味變重，與刺梨果香的香氣不夠協(xié)調(diào)，且果酒苦澀味增加，感官評(píng)分有所回降，這與之前關(guān)于無(wú)花果山楂復(fù)合果酒的釀造工藝報(bào)道的趨勢(shì)類(lèi)似[26]。由于發(fā)酵時(shí)間變長(zhǎng)，酵母生長(zhǎng)旺盛，代謝能力增強(qiáng)，殘?zhí)沁M(jìn)一步減少，酒精度漸漸增加，而總酸的含量可能升高，因而影響果酒的口感、風(fēng)味，使得刺梨果酒酸甜不夠協(xié)調(diào)。綜上，刺梨果酒的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)該選在7 d。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)刺梨果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件將上述3個(gè)因素分析后，設(shè)計(jì)出17組試驗(yàn)方案，根據(jù)軟件給出的試驗(yàn)順序進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 刺梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Rosa roxburghii fruit wine

續(xù)表

利用Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得感官評(píng)價(jià)對(duì)初始糖含量、酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

2.2.2 方差分析

方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，模型P=0.0014（P＜0.01），說(shuō)明模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.083 7（P＞0.05），不顯著。對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，一次項(xiàng)A（初始糖含量）及二次項(xiàng)A2、B2對(duì)刺梨果酒感官評(píng)分的影響極顯著（P＜0.01），其余因素對(duì)刺梨果酒感官評(píng)價(jià)影響不顯著（P＞0.05）。各因子對(duì)刺梨果酒感官評(píng)分的影響依次是A（初始糖含量）＞C（發(fā)酵時(shí)間）＞B（酵母接種量）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.3 因素間交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面及其等高線圖可評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的相互作用及其對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響，以確定各因素的最佳水平范圍，繪制各因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖4。響應(yīng)面等高線的形狀反映了兩因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形說(shuō)明兩因素交互作用顯著，圓形則說(shuō)明兩因素交互作用不顯著。從響應(yīng)面圖中可直觀看出因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖及方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)刺梨果酒感官評(píng)價(jià)的影響大小為初始糖含量＞發(fā)酵時(shí)間＞酵母接種量。

圖4 初始糖含量、酵母添加量及發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)刺梨果酒感官評(píng)價(jià)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar concertation,yeast inoculum and fermentation time on sensory evaluation of Rosa roxburghii fruit wine

圖4（a）顯示了初始糖含量和酵母接種量的交互作用，當(dāng)初始糖含量一定時(shí)，隨著酵母添加量的增加，感官評(píng)分含量先增加后減少。圖4（b）顯示了初始糖含量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用，發(fā)酵時(shí)間較少時(shí)，初始糖濃度增加，感官評(píng)分也隨之增加；發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，初始糖含量增加，感官評(píng)分先增加后減少。初始糖含量一定時(shí)，感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。圖4（c）顯示了酵母添加量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用。通過(guò)對(duì)回歸模型方程求解，得出刺梨果酒的前發(fā)酵釀造工藝為初始糖含量270.69 g/L，酵母接種量4.43%，發(fā)酵時(shí)間8 d，在此條件下響應(yīng)值最大為83.52分。

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證

通過(guò)該回歸方程得到優(yōu)化后的工藝參數(shù)，即初始糖含量270.69 g/L，酵母接種量4.43%，發(fā)酵時(shí)間8 d。為驗(yàn)證模型的可預(yù)測(cè)性，同時(shí)考慮到實(shí)際操作中的可行性，將工藝條件調(diào)整為：初始糖含量270 g/L，酵母接種量4.5%，發(fā)酵時(shí)間8 d，在此條件下對(duì)刺梨果酒前發(fā)酵工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果得出其感官評(píng)價(jià)得分為83分，酒精度為12%vol，與預(yù)測(cè)值較為相近，因此運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果酒釀造工藝的回歸模型可行。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果表明刺梨果酒前發(fā)酵工藝條件為初始糖含量270 g/L，酵母接種量4.5%，發(fā)酵時(shí)間8 d。在此條件下釀造的刺梨果酒感官評(píng)分最高為83分，苦澀味明顯減輕，酒體色澤呈淺棕色，澄清透亮，酒香協(xié)調(diào)無(wú)異味，酸甜適中，酒精度為12%vol。