PCB118誘發大鼠胰島素抵抗及對骨骼肌細胞功能的影響

湯金梅 呂榮 畢亭亭 凌玲 徐曉 黃祺 喬慧瑛 楊緒楓

(蘇州市第九人民醫院老年醫學科，江蘇 蘇州 215200)

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足或者胰島素不能正常發揮生理功能的內分泌代謝紊亂疾病，是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大威脅人類健康的慢性疾病，是一個在全國乃至全世界均嚴峻的公共衛生問題〔1〕。糖尿病目前發病原因仍不甚清楚，目前認為遺傳因素、環境因素是其主要病因，特別是環境因素起著越來越重要的作用〔2〕。環境內分泌干擾物(EEDs)是一種能對生物或人的生殖、發育、免疫系統功能起重要影響的化學物質，多氯聯苯(PCBs)是EEDs的一種，其生物活性極其穩定，并具有親脂性，能夠蓄積于肝臟、腎臟、肺等器官的脂肪組織中，并通過食物鏈逐級的富集，對人群健康產生重要影響〔3〕。目前有研究表明暴露于低水平的PCB中能夠增加胰島素抵抗及2型糖尿病的患病風險〔4〕。PCB118在PCB中最具代表性，能夠評估環境中總的PCB，本課題組前期研究證實低劑量的PCB118暴露降低了大鼠胰島素敏感性，本課題組將進一步探討其具體機制。

1 材料與方法

1.1動物 40只清潔級體重(200±20)g的健康雄性Wistar大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。大鼠在SPF級，(20±2)℃動物房飼養，5只/籠，自由飲水、攝食。

1.2主要試劑與儀器 PCB118標準品購于美國AccuStandard公司；葡萄糖試劑盒購于北京中生北控生物科技股份有限公司；糖化血紅蛋白試劑盒購于南京建成生物技術有限公司；胰島素免疫吸附試劑盒購于美國R&D公司；反轉錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)購于大連寶生生物技術有限公司；肌醇激酶(IRE)1α、磷酸化(p)-IRE1α、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2、p-JNK1/2、胰島素受體底物(IRS-1)、p-IRS-1、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)-4及GAPDH購于美國Abcam公司。Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度計購于美國Thermo公司；Multiskan FC酶標儀購于Thermo Fisher公司。

1.3動物模型的建立〔5〕將大鼠隨機分為正常對照組，低、中、高劑量組，每組大鼠10只。低、中、高劑量組大鼠每組分別腹腔注射10、100、1 000 μg/(kg·d)的PCB118(PCB118溶解于玉米油溶液中)，正常對照組大鼠腹腔注射等體積的玉米油，每周給藥5 d，連續13 w。

1.4樣品的制備及相關指標的檢測 大鼠末次給藥禁食5 h后，尾靜脈采血，加入蛋白沉淀劑，離心獲得上清液，根據試劑盒說明書測定大鼠空腹血糖(FBG)含量。HbA1c的測定方法：通過購自深圳普門科技公司的GH-900Plus全自動型糖化血紅蛋白檢測分析儀及配套的試劑進行測定，嚴格遵照說明書的步驟進行操作。將大鼠麻醉，腹主動脈采血于抗凝管，3 000 r/min離心15 min取上清液，根據試劑盒說明書采用空腹血清胰島素(FINs)測定FINs水平。計算胰島素敏感指數(ISI)，ISI=ln〔1/(FBG×FINs)〕。根據HOMA模型計算胰島素抵抗指數(IRI)，IRI=(FINs×FBG)/22.5。同時將麻醉后的大鼠后肢內側皮膚剪開，使股四頭肌暴露出來，順著股骨方向用眼科剪將肌肉組織剪下來，并保存于-80℃冰箱備測。

1.5Realtime-PCR法檢測骨骼肌組織IRE1-α、JNK1/2、IRS-1及GLUT-4 mRNA的表達 根據Trizol試劑盒說明書提取骨骼肌組織中總RNA，DEPC水溶解RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度，當檢測出的RNA純度(OD260 nm/OD280 nm=1.8)良好時候，根據反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，反應條件：30℃ 6 min，40℃ 20 min。最后進行Realtime PCR分析，預變性95℃，15 min；變性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40個循環。用2-△△Ct法分析mRNA表達量。

1.6Western印跡檢測細胞中IRE1α/JNK/IRS-1信號通路相關蛋白的表達 將骨骼肌組織勻漿并加入含有蛋白酶抑制劑及PMSF的細胞裂解液裂解30 min，4℃離心，收集上清液。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上樣，進行12%十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，轉聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的BSA室溫下孵育1 h，兔抗IRE1α、p-IRE1α、JNK1/2、p-JNK1/2、IRS-1、p-IRS-1、GLUT-4多克隆抗體溶液4℃過夜孵育，第2天室溫孵育二抗，最后根據化學發光免疫試劑盒說明書在凝膠成像系統中曝光各蛋白條帶，并分析條帶灰度值。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1PCB118對大鼠FBG、FINs及HbA1c的影響 與正常對照組比較，低、中、高劑量組FBG、FINs及HbA1c均顯著提高(P<0.01)。見表1。

表1 PCB118對大鼠FNG、FINs及HbA1c的影響

2.2PCB118對大鼠IRI、ISI的影響 與正常對照組比較，低、中、高劑量組ISI減低、IRI提高(P<0.01)。見表2。

表2 PCB118對IRI、ISI的影響

2.3PCB118對大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號通路mRNA表達量的影響 與正常對照組比較，低、中、高劑量組IRE1α、JNK1/2、IRS-1 mRNA表達量上調(P<0.01)，GLUT-4 mRNA表達量下調(P<0.01)。見表3。

表3 PCB118對大鼠骨骼肌中IRE1-α/JNK/IRS-1信號通路mRNA表達量的影響

2.4PCB118對大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號通路蛋白表達量的影響 與正常對照組比較，低、中、高劑量組p-IRE1α、p-JNK1/2、p-IRS-1表達量上調(P<0.01)，GLUT-4蛋白表達量下調(P<0.01)。見圖1、表4。

1～4：正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖1 PCB118對大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號通路蛋白表達量的影響

表4 PCB118對大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信號通路蛋白表達量的影響

3 討 論

2型糖尿病在我國糖尿病人群中約占90%，胰島素缺乏或者抵抗是2型糖尿病的重要發病機制〔6〕。胰島素抵抗主要是指胰島素的靶器官及外周組織對胰島素敏感性降低，致使胰島素所產生的生物學效應降低，而機體為了維持內環境穩定，代償性地促進胰島素分泌，所導致的高胰島素血癥。其中長期的高血糖將使機體的糖、脂肪、蛋白質代謝異常，產生有毒物質，因此FBG是反映糖尿病嚴重程度及恢復程度的直接指標。HbA1c在一定時間內與血糖濃度呈相關關系，能反映機體的血糖水平。FINs最重要的功能是調節機體血糖水平，能使機體血糖濃度不管是餐后還是饑餓狀態均處于一定范圍內。因此一定程度上的調控2型糖尿病患者糖代謝及胰島素敏感性對于疾病的預防及治療具有重要作用。

PCB118是PCBs中最持久的一種同系物，是評估環境中總PCBs的直接指標。PCB118普遍存在于我國長江三角洲的水、土壤、水生生物及泥樣中，也存在于江蘇南部的土壤樣本中，同時在人體的組織及母乳中也發現一定的含量。在市售禽類食品中，PCB118也是PCBs中含量最大的單體。而且研究還表明PCB118的暴露對于人體生殖系統、皮膚功能、免疫系統及行為改變具有顯著的影響。在3T3-L1脂肪細胞中，PCB118和PCB138(非二噁英PCB)能顯著促進脂肪細胞分化，并增加脂質滴的大小。腹腔注射給予C57BL/6小鼠PCB118或PCB138，也能顯著增加脂肪質量和脂肪細胞大小。同時兩種PCB在體內外都能顯著誘導胰島素抵抗，抗糖尿病藥物二甲雙胍能減輕PCB誘導的胰島素抵抗〔7〕。且本課題組前期研究證實低劑量的PCB118暴露降低了大鼠胰島素敏感性〔8〕，所以本研究在前期研究基礎上進一步探討PCB118對大鼠胰島素抵抗的作用，結果表明PCB118顯著提高大鼠FBG、FINs、HbA1c含量及IRI，減低ISI，進而說明PCB118能誘發大鼠胰島素抵抗。

骨骼肌、肝臟、脂肪是胰島素抵抗發生的主要靶器官，人體80%葡萄糖的攝取和消耗均是通過骨骼肌實現的，因此骨骼肌作為胰島素抵抗的主要靶器官在糖尿病的發生發展過程中起著重要作用〔9〕。在生理條件下，胰島素與骨骼肌細胞上的胰島素受體結合，使IRS-1磷酸化，進而激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，并引發后續一系列蛋白質磷酸化級聯反應，促使GLUT-4移位到細胞膜上，葡萄糖從細胞外轉運到細胞內，最終完成胰島素刺激的骨骼肌細胞葡萄糖的攝取。在整個過程中主要涉及IRS-1被激活后所引起的生物學反應。研究顯示PCB代謝產物會導致蛋白質的錯誤折疊，內質網是真核細胞中蛋白質折疊、翻譯、合成的重要場所，因此對細胞的應激反應起著重要調節作用。內質網應激(ERS)與肝臟、肌肉的胰島素抵抗密切相關。研究顯示ERS發生后，能夠迅速激活IRE1α，進而激活JNK信號通路，被激活的JNK信號通路能夠通過一系列激酶反應使IRS1發生磷酸化，阻斷胰島素信號傳導，抑制胰島素生物學效應，使胰島素抵抗發生。IRE1是存在于內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，由兩個亞型，分別為IRE1α、IRE1β。其中IRE1β緊存在于腸上皮細胞，而IRE1α能夠廣泛存在于各種細胞中，并具有激酶和內切酶活性，在ERS主導的細胞應激反應中起著重要作用。JNK是一種絲裂原蛋白酶激酶家族的主要成員之一，由三個亞型，分別為JNK1、2、3。JNK1、2能夠廣泛存在于人體各種細胞中，而JNK3則只表達于睪丸、心臟、腦組織中。被活化后的JNK能夠激活IRS1在絲氨酸307位點發生磷酸化，并減弱胰島素的敏感性。研究顯示胰島素能夠通過激活IRE1-α刺激X盒結合蛋白1(Xbp1s)生成，Xbp1s進一步提高IRS-1及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平，進而增加了過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)γ活性、GLUT4在細胞表面的易位及脂肪細胞中葡萄糖的攝取〔10〕。有研究也表明短期暴露于PCB118，能提高小鼠循環三酰甘油水平，同時也觀察不到炎癥因子的變化，但在肝臟組織及脂肪組織中發現脂素基因(LIPIN)1和GLUT4表達的下調〔5，11〕。因此本研究進一步探討PCB118對IRE1α/JNK/IRS-1信號通路相關蛋白表達量的影響，結果表明PCB118能顯著上調大鼠骨骼肌中IRE1α、JNK1/2、IRS-1表達，下調GLUT-4表達，進而誘發大鼠胰島素抵抗。