PPARγ甲基化與慢性腎臟病患兒腎間質纖維化的關系*

潘競, 覃遠漢, 蔣玲, 席志楊, 涂立, 蹇淑娟

廣西醫科大學第一附屬醫院兒科(廣西南寧 530021)

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是腎間質由大量成纖維細胞聚積形成，是各種慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進展到終末期的共同病理表現，與腎功能損害密切相關，RIF發展的程度越高預示著腎功能損害程度越重。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator aetivated receptor gamma，PPARγ)是轉錄因子核受體家族成員之一，參與細胞分化、脂質代謝、炎癥、免疫調節等機體多種功能調節，且與糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化等疾病密切相關[1-2]。Lu等[3]研究發現，PPARγ的激活在改善RIF的發展和治療CKD方面具有潛在的價值。為此，我們采用重亞硫酸鹽擴增子測序(BiSulfite Amplicon Sequencing，BSAS)的方法，進行PPARγ甲基化與CKD患兒RIF狀態的關系分析，從表觀遺傳學范疇探討PPARγ甲基化可能參與RIF發生、發展的機制。

1 資料與方法

1.1 對象與分組 選取廣西醫科大學第一附屬醫院兒科病房2014—2019年經腎穿刺活檢術確診的各類CKD患兒共75例，其中，病理表現為RIF(RIF組)33例；非RIF(非RIF組)42例。選擇本院體檢中心正常健康兒童51例作為正常對照組(正常組)。本研究已獲本院倫理委員會審核批準，同時患兒監護人或患兒本人知情同意。

1.2 主要試驗材料 血液基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，中國)；NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)；MiSeq v.3試劑盒(Illumina，San Diego，CA，美國)；EZ DNA甲基化-GOLD試劑盒；HT1緩沖液(Illumina，San Diego，CA，美國)；Qubit 2.0(Invitrogen，美國)；Gnome Size Selector磁珠(Huijie，Wujiang，中國)；安捷倫2100生物分析儀(Agilent Technologies)；Illumina MiSeq臺式測序儀；Miseq平臺(Illumina，San Diego，CA，美國)。

1.3 DNA亞硫酸氫鹽轉化和亞硫酸氫鹽特異性PCR 收集各組患兒外周靜脈EDTA抗凝血約2 mL，按照DNA提取試劑盒說明書提取患兒血液基因組DNA，應用重亞硫酸氫鹽甲基化轉化修飾后進行PCR擴增，上游引物5′-TGTTAAAAAGGGTAAAGGTTTTGAG-3′，下游引物5′-CTCTACTAATTTATAAAACCCAAAATAA-3′，片段長度367 bp。反應體系為25 μL: Takara Ex Taq HS (RR006A)0.25 μL,10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mM each)2 μL,DNA甲基化轉化溶液(Template)1.5 μL,上游引物(10 μmol/L)0.5 μL,下游引物(10 mmol/L)0.5 μL,無酶水17.75 μL，反應條件：95℃預變性5 min，58℃變性20 s，72℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進行45個循環;將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.4 甲基化測序文庫制備 將上步產物根據Miseq平臺使用TruSeq DNA PCR的文庫制備技術，取500 ng DNA，進行末端修復，3′末端加A及adaptor連接，使用磁珠純化PCR文庫，并以10 μL MilQ洗脫。用生物分析儀對雙鏈文庫進行質量檢查，以確定文庫大小和摩爾濃度，并通過qPCR進行文庫效率檢查，引物為測序文庫通用引物，最后將DNA文庫在MilQ中稀釋至2 nmol/L。

1.5 甲基化測序 DNA文庫取5 μL (4 μm)放入1.5 mL離心管內添加5 μL NaOH(0.2N)變性5 min，用測序稀釋液稀釋至1 000 μL，將稀釋后的文庫加入到測序試劑盒指定區域內，放入儀器內啟動測序程序進行測序反應。

2 結果

PPARγ基因啟動子擴增片段中，各甲基化位點相對位置分別為第71位、第85位、第163位、第257位。RIF組、非RIF組及正常組間PPARγ基因各位點甲基化情況，見表1。與正常組相比，在第71和第85兩個位點RIF組和非RIF組甲基化比例均顯著低于正常組(H=-23.18、-21.05、-28.21、-27.60，P<0.05)，而RIF組和非RIF組兩組間差異無統計學意義(H=-2.13、-0.61,P>0.05)，在第163和第257兩個位點中，各組PPARγ基因甲基化均差異無統計學意義(H=0.90、2.60，P>0.05)。

表1 各組PPARγ基因在不同位點甲基化情況

3 討論

表觀遺傳學機制是通過對DNA修飾從而改變基因表型，而DNA甲基化是真核生物調控基因表達的主要表觀遺傳機制之一[4]。在真核生物中，DNA甲基化在CpG二核苷酸(稱為CpG島)發生最為普遍，CpG島是長度為0.5～2 kb的區域，存在于人類所有基因高達50%的5′端啟動子區域中，在DNA甲基轉移酶作用下，甲基從輔助因子S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)轉移到DNA中胞嘧啶環的第5位碳原子并與其共價鍵結合，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)，即DNA甲基化[5-7]。在DNA甲基化轉移酶的作用下，DNA啟動子構象發生改變，導致基因失活，在生物體內mRNA表達降低，反之，低甲基化可能使基因在生物體內mRNA表達升高。

DNA甲基化已被證實參與多種組織器官纖維化疾病發生、發展，如研究發現，在慢性丙型肝炎[8]中，RASSF1A和P16基因啟動子甲基化頻率增高；特發性肺纖維化(IPF)[9]全基因組甲基化分析中，發現多個基因啟動子位點發生甲基化改變，且與基因mRNA表達顯著相關；肝纖維化小鼠模型的肝臟組織[10]中，鈣調磷酸酶調節劑1(RCAN1)的亞型RCAN1.4基因啟動子發生異常甲基化，致RCAN1.4 mRNA表達降低；單側輸尿管梗阻(UUO)誘導的小鼠腎臟纖維化[11]中，Klotho基因啟動子發生高甲基化，使Klotho基因表達異常。以上均表明在不同疾病致纖維化發生進展過程中，伴有基因啟動子異常甲基化。

DNA甲基化與腎臟疾病發生、發展有關[12]。蔡雅萍等[13]研究發現，在CKD5期患者中去甲腎上腺素轉運體基因(SLC6A2)啟動子甲基化頻率異常升高，提示SLC6A2基因異常甲基化與CKD5期有關。陳靜等[14]報道，CKD患者腎臟組織中外周血單個核細胞(PBMC)Klotho基因啟動子甲基化率升高，且與腎小管間質纖維化面積呈正相關，均提示提示DNA甲基化可能參與CKD發生、發展。Li等[15]發現，腎細胞癌中，PON1基因呈現高甲基化，抑制腎細胞癌組織中PON1基因mRNA及蛋白表達下調，促使腎癌細胞的遷移、侵襲和增殖，使用PON1基因去甲基化制劑后，抑制腫瘤的生長，表明PON1基因甲基化參與腎細胞癌發生、發展；在CKD腎性貧血患者[16]中，促紅細胞生成素(EPO)和缺氧誘導因子-2α(HIF-2α)基因的啟動子區高度甲基化，并且隨著CKD的進展，這些基因的表達被沉默。

PPARγ具有抗細胞增殖、炎癥反應和組織纖維化的多效性功能，可能參與腎損傷后的繼發性缺氧、缺血、再生和修復過程[17]。Panchapakesan等[18]發現，PPARγ激動劑能限制近端小管的促炎癥反應，早期應用能限制糖尿病腎病的發展。Kohno等[19]報道，PPARγ激動劑能抑制單側輸尿管梗阻模型中RIF的程度，表明PPARγ激動劑能減輕RIF和炎癥反應；研究發現[20]，PPARγ激動劑羅格列酮通過PPARγ調節轉化生長因子-1(TGF-1)和肝細胞生長因子(HGF/c-Met)，對高草酸尿產生抗氧化作用，減輕晶體沉積。

研究發現，PPARγ基因異常甲基化參與多種疾病發生、發展[21]。如在慢性乙型肝炎急性肝衰竭患者[22]中，PPARγ啟動子甲基化明顯減弱，PPARγ mRNA表達水平升高；在結腸癌(colon cancer，CC)患者血液及癌組織樣本[23]中，檢測出PPARγ啟動子甲基化水平增加，甲基化患者的PPARγ mRNA及蛋白表達較未出現甲基化患者低，表明PPARγ啟動子甲基化能抑制PPARγ mRNA及蛋白表達；在乳腺癌患者血清[24]中，檢測到PPARγ基因甲基化程度增高；在豬肌內前脂肪細胞[25]中，由甲基化轉移酶3A(DNMT3A)介導PPARγ基因甲基化水平上調，并顯著抑制PPARγ基因表達，抑制肌內前脂肪細胞分化。

因此推測，在PPARγ基因參與CKD病致腎臟纖維化疾病發生、發展過程中，發生了PPARγ基因啟動子異常甲基化。在本研究中，RIF組和非RIF組PPARγ甲基化比例較正常組均顯著降低，因此推測，低甲基化狀態可能導致PPARγ基因在CKD病中表達改變，PPARγ參與腎臟抗炎抗纖維化作用機制可能與PPARγ低甲基化有關。本研究結果顯示，CKD患兒中， RIF組及非RIF組PPARγ甲基化比例在第71及第85位點較正常組均明顯降低，但RIF組及非RIF組之間甲基化比例無明顯差異，提示PPARγ低甲基化狀態可能參與患兒CKD的發生發展，但并非RIF這一階段所特有，可能在CKD早期中，PPARγ低甲基化狀態就已出現。因此，隨著患兒CKD病程的逐漸進展，可能伴隨著PPARγ低甲基化，但具體發生在哪一階段目前尚未清楚。Harald等[26]研究發現，腎功能中度或重度受損的患者PPARγ mRNA表達明顯高于腎功能正常者，而在腎臟組織中PPARγ的mRNA表達改變是否與PPARγ低甲基化有關，還需進一步實驗證實。

綜上所述，PPARγ甲基化水平降低可能在RIF出現前已發生，PPARγ低甲基化可能參與CKD發生、發展。