AngⅡ及AT1R在膀胱腫瘤發生發展及浸潤轉移中的意義*

涂小峰, 李中軍, 韓新軍, 胡義

1鄭州市第七人民醫院急診科(河南鄭州 450016)； 2河南省人民醫院泌尿外科(河南鄭州 450003)

膀胱癌是泌尿外科常見的一類生殖系統惡性腫瘤，在男性中發病率較高，是女性的3～4倍，其患病率呈逐年增加趨勢[1-2]。膀胱癌好發于為50～60歲人群，其發病率和進展復發率均較高，若未得到及時診治，從出現癥狀到病死時間平均16個月[3-4]。預后控制不佳主要歸因于尚未完全闡明膀胱癌的發病機制，膀胱癌細胞浸潤深度、轉移程度及分化程度對患者預后影響最大。因此，闡明膀胱癌發生、進展及浸潤轉移的分子機制，尋找有效的生物分子標志物用于早期診治及預后評估將具有重要的臨床意義。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統中活性小分子多肽，主要作用是調節心血管和腎臟穩態及水、電解質代謝平衡，AngⅡ主要是通過血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ 1 receptor,AT1R)來發揮生理調節作用這些細胞效應的[5]。近年研究發現,AngⅡ及AT1R參與肝癌、胃癌等多種癌癥組織表達上調[6]，腫瘤血管生成是腫瘤發生、發展、浸潤和轉移過程中的關鍵環節，而研究發現AngⅡ及AT1R與腫瘤的血管生成、增殖和轉移緊密相關，AngⅡ及AT1R的表達增加，意味著臨床分期晚和浸潤更深，預后不佳[7-9]。但它們表達及失衡情況與膀胱癌發展、浸潤轉移的關系尚未見報道。本研究免疫組化SP法和熒光定量RT-PCR檢測60例膀胱癌患者AngⅡ及AT1R表達情況，探討其與膀胱癌發生、發展及浸潤轉移的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6 月至2019年12月鄭州市第七人民醫院收治的術后膀胱癌組織及其癌旁正常膀胱癌組織60例，其中男35例，女25 例，年齡30～70歲，平均(53.46±5.65) 歲，根據TNM分期標準進行臨床分期: 其中Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期10例，腫瘤最大徑1～5 cm，平均(3.63±0.56)cm。納入標準：(1)經術后病理組織確診為膀胱癌[10]；(2)術前未接受任何放化療治療；(3)無精神認知功能障礙，可進行良好溝通；(4)患者或其家屬簽署知情同意書。排除標準: (1)合并有心、肝、腎嚴重功能不全患者；(2)妊娠及哺乳期婦女；(3)不同意參加研究者。研究已經鄭州市第七人民醫院倫理委員會審批(批號：L2017011)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化檢測AngⅡ及AT1R蛋白表達 多聚甲醛固定標本，石蠟包埋，進行連續切片，約4 μm厚，經常規脫蠟，抗原修復，使用3%的過氧化氫避光孵育30 min抑制內源性氧化酶，用山羊血清封閉，加入一抗工作液(AngⅡ和AT1R兔抗人多克隆抗體，稀釋比均為1∶150)，4℃孵育過夜，生物素標記的二抗37℃孵育60 min，采用DAB顯色蘇木素復染3 min，常規脫水，中性樹膠封片，采用已知表達性的切片作為陽性對照，使用PBS 緩沖液代替一抗性作為陰性對照。

1.2.2 熒光定量RT-PCR檢測AngⅡ及AT1R mRNA表達 二甲苯脫蠟，無水乙醇洗去殘留二甲苯，室溫干燥，加入組織裂解液和蛋白酶K于55℃金屬浴孵育器2 h；根據Trizol法提取組織總RNA。用紫外分光光度計測定RNA濃度，并計算總RNA的A260/A280，比值在1.6～2.0范圍即為純度合格，取1 μg RNA進行逆轉錄合成cDNA，嚴格根據TAKARA公司的逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒說明步驟進行逆轉錄反應和PCR反應。以β-actin為內參照，去離子水作為陰性對照。引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列見下表，反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環；最后于72℃ 5 min，采用2-ΔΔCt表示表達量。

表1 引物序列

1.3 指標觀察和標準 AngⅡ及AT1R 均著色在細胞的胞質和胞膜上，AngⅡ染色為淺黃色、棕黃色或深棕色。AT1R染色為淺黃色、棕黃色或棕褐色，所有切片均隨機取5個視野在400倍高倍鏡下觀察，根據陽性細胞著色程度及陽性細胞百分比進行評分。著色程度評分：未著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，深棕色或棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞百分比<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。著色程度+陽性細胞百分比評分為總分，10分以下分為陰性，10分及以上為陽性[11]。

2 結果

2.1 AngⅡ及AT1R蛋白在癌組織及旁癌組織中的表達情況 膀胱癌組織AngⅡ及AT1R蛋白表達明顯高于癌旁正常膀胱癌組織，差異有統計學意義(P<0. 05)，見表2、圖1。

表2 AngⅡ及AT1R蛋白在癌組織及旁癌組織中表達情況 例(%)

注：A：AngⅡ在膀胱癌組織中表達，B：AngⅡ在膀胱癌旁組織中表達，C：AT1R在膀胱癌組織中表達，D：AT1R在膀胱癌旁組織中表達

2.2 AngⅡ和AT1R mRNA在癌組織及旁癌組織中的表達 膀胱癌組織AngⅡ的 mRNA相對表達量為1.89±0.51，癌旁組織的為1.06±0.25，膀胱癌組織AT1R mRNA相對表達量為1.95±0.53，癌旁組織的1.04±0.21，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 AngⅡ蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關系 AngⅡ蛋白及mRNA在膀胱癌組織中的表達均與腫瘤的分化程度、臨床分期、浸潤和淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(P>0.05)，見表3。

2.4 AT1R蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關系 AT1R蛋白及mRNA在膀胱癌組織中的表達均與腫瘤的分化程度、臨床分期、浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移有關，而與患者性別、年齡及腫瘤大小無關，見表4。

2.5 AngⅡ和AT1的影響因素logistic回歸分析 以性別(男=0，女=1)、年齡(≥50歲=1，<50歲=2)、腫瘤直徑大小(≤3 cm=0，>3 cm=1)、分化程度(低分化=1，中分化=2，高分化=3)、浸潤深度(淺表浸潤=1，肌層浸潤=2)、TNM分期(Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、淋巴結是否轉移(無=0，有=1)為自變量，以AngⅡ及AT1R為因變量，多因素logistic回歸分析結果顯示，膀胱癌患者的分化程度、浸潤深度、腫瘤分期及淋巴結轉移會明顯影響AngⅡ及AT1R的表達，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5～6。

表3 AngⅡ蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關系

表4 AT1R蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關系

表5 AngⅡ的影響因素logistic回歸分析

表6 AT1R的影響因素logistic回歸分析

3 討論

膀胱癌是最常見的泌尿系統腫瘤，主要來源于膀胱上皮組織和間質組織。膀胱癌根據組織學類型可分為移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌及混合型[12]。其中移行細胞癌占絕大部分，根據浸潤程度，淺表性約占70%，20%為浸潤性[13-14]，目前臨床上治療膀胱癌采用手術治療為主的綜合治療，但預后較差，主要原因是確診時大多已發生轉移并且膀胱癌復發率高[15],因此實現早期診斷膀胱癌對于改善預后具有重要意義，然而目前的技術手段仍有一定難度。從目前研究來看，細胞浸潤深度和轉移對預后影響頗大，從分子和基因層面來看，膀胱癌的浸潤和轉移具有明顯的遺傳特征，但膀胱癌轉移的分子機制尚未完全闡明。故探討膀胱癌進展及浸潤轉移的分子機制，有效評估膀胱癌轉移及預后對于延長患者生存期和改善預后具有重要的意義。

以往研究AngⅡ和AT1R的功能主要集中于調節心血管功能，如參與調節血管的收縮、細胞增殖、遷移、凋亡和分化，以及形成細胞外基質和炎癥。近年來AngⅡ和AT1R在腫瘤中的作用受到國內外學者的關注[16]。但其在膀胱癌進展和浸潤轉移中的作用卻鮮見報道，對此，本研究采用免疫組化SP法和熒光定量PCR檢測PTC 組織及癌旁正常膀胱癌組織的AngⅡ和AT1R蛋白和mRNA表達情況，結果發現膀胱癌組織的AngⅡ和AT1R 蛋白和mRNA明顯高于癌旁正常組織，提示AngⅡ和AT1R與膀胱癌的進展密切相關。通過分析AngⅡ和AT1R與臨床病理特征相關性發現，AngⅡ及其AT1R與分化程度、臨床分期、浸潤和淋巴結轉移有關，意味著臨床分期越晚，組織分化越差，浸潤程度更深和淋巴結轉移越嚴重，則表達水平越高,表明AngⅡ及其AT1R是浸潤轉移的重要分子標志。膀胱腫瘤的發生、發展及浸潤轉移屬于多因素參與的病理生物學過程。侵襲轉移包括腫瘤細胞在機體內的一些列過程，包括腫瘤細胞的運動、黏附、遷移、生長、新血管生成、逃避免疫等多種行為。據以往研究顯示在腫瘤組織中，AngⅡ主要通過AT1R結合通過激活促使了腫瘤的生長以及轉移，而可以促進腫瘤的生長以及腫瘤血管的生成，AT1R可促進細胞增殖激活表皮生長因子受體，激活ERK1/2級聯效應，并持續激活細胞信號轉導因子，進而調節靶基因轉錄表達，包括編碼抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相關蛋白cyclin D1和myc，以及促血管發生因子VEGF，促使細胞的異常增殖并阻斷其凋亡[17-20]。Dolley-Hitze等[21]通過免疫組織化學法、蛋白質印跡法和實時定量聚合酶鏈反應法檢測發現，AT1R在腎透明細胞癌中的表達明顯高于在正常組織中的表達。Shirotake等[22]對檢測膀胱腫瘤組織AT1受體，發現在肌層浸潤膀胱癌組織AT1受體陽性表達率為76%，明顯高于非肌層浸潤組織的43%。Arrieta等[23]發現AT1受體陽性表達強度與星形膠質瘤腫瘤惡性分級、細胞增殖、血管增生明顯相關。進一步的，多因素分析顯示膀胱癌患者的分化程度、浸潤深度、腫瘤分期和淋巴結轉移會明顯影響AngⅡ及AT1R的表達，進一步證實了AngⅡ及AT1R的表達與膀胱癌患者浸潤轉移的關系。本研究結果提示AngⅡ及AT1R的表達上調與膀胱腫瘤的發生發展、浸潤轉移密切相關，高表達的AngⅡ及AT1R提示膀胱腫瘤細胞更具有明顯的侵襲性。因此，可通過檢測膀胱腫瘤組織AngⅡ及AT1R表達評估膀胱腫瘤的發生發展和浸潤轉移程度，以及膀胱癌的預后，可通過給予針對性的治療延緩膀胱癌的發生、發展和浸潤轉移。

綜上所述，AngⅡ及AT1R mRNA在膀胱癌組織中表達上調，其表達量與膀胱癌的分化程度密切相關。提示AngⅡ及AT1R有望成為膀胱癌侵襲轉移的預測指標，且可望成膀胱癌靶向治療的有效靶點。