高原地區胃癌病人組織低氧誘導因子表達與臨床特征及預后相關性研究

李欣 林明哲 趙久達

胃癌是一種惡性腫瘤。在腫瘤增長的過程中，由于內部血流灌注不足，導致細胞內氧消耗大于供給，從而產生缺氧，形成低氧微環境。細胞對于低氧應激的關鍵信號通路是低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)信號通路[1-3]。HIF與腫瘤的血管生成、增殖、侵襲及產生耐藥性等都具有緊密的聯系[4-8]。HIF家族主要由HIF-1、HIF-2和HIF-3構成。HIF家族主要是由α和β亞基組成的異源二聚體，其中調控低氧的的主要功能亞基是α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)[9-13]。本文選取HIF-1α代表HIF家族來研究HIF在胃癌病人中的表達以及與預后的相關性。

對象與方法

一、對象

2015年9月～2017年7月在我院治療的胃癌病人62例，均行胃癌根治術。其中男性36例，女性26例，年齡56～68歲，平均年齡(58.0±5.8)歲，均為開腹手術。由外科醫生提供胃癌原發灶組織以及距胃癌原發灶邊緣5 cm的癌旁組織。納入標準：(1)手術之前均未進行過化療和放療；(2)腫瘤組織標本均經病理學檢查確診為胃癌。排除標準：其他惡性腫瘤、免疫系統疾病、血液系統疾病、心腦血管疾病病人；嚴重肝腎功能障礙。

二、方法

1.免疫組織化學染色：采用免疫組織化學染色鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidin peroxidase，SP)法檢測HIF-1α在胃癌組織及正常胃組織中的表達情況。石蠟切片常規脫水后進行抗原修復，采用H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，封閉非特異性位點；滴加一抗，4 ℃孵育過夜置于室溫，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗后滴加生物素標記的二抗，37 ℃溫箱內孵育35分鐘；PBS沖洗后滴加SP復合物，37 ℃溫箱內孵育30分鐘；PBS沖洗，二甲基聯苯胺顯色5分鐘；自來水沖洗，蘇木素復染10分鐘；自來水沖洗10分鐘，鹽酸酒精分化2～3秒；自來水沖洗，溫水浸泡返藍30分鐘；脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5分鐘；中性樹脂封片。采用已知的HIF-1α陽性表達的胃癌切片作為陽性對照，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

2.高效液相色譜法：將胃癌和癌旁組織的經過苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，體積比) 法提取組織 DNA，再將DNA經過酶解后采用色譜柱為Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250.0 mm，5 μm);流動相為0.2%(體積分數)磷酸;流速為1.3 ml/min;檢測波長為273 nm；進行HPLC分析，計算得出DNA甲基化水平。

3.表達分析：采用獨立樣本t檢驗以及bootstrap方法檢驗比較胃癌組織與癌旁組織之間HIF-1αmRNA及DNA甲基化的表達差異，并用Pearson對兩者差異進行相關性分析。

4.生存分析：以接受者操作特性(receiver operating characteristiccurve，ROC)曲線的約登指數最小值(總生存分析和無復發生存分析分別為1.421和3.386)作為HIF-1αmRNA表達的分割點，將胃癌病人分為HIF-1α高表達組和低表達組；繪制出總生存生存曲線和無復發生存曲線，采用Kaplan-Meier法；再分別比較兩組之間的總生存率和無復發生存率，方法選擇采用對數秩和檢驗(Log-rank)。

5.免疫組織化學染色結果判定：HIF-1α蛋白表達主要位于細胞質和細胞膜，呈棕黃色顆粒狀。由兩名病理醫師采用雙盲法對切片進行觀察，每張切片隨機選擇10個高倍視野(×400)，每個高倍視野計數100個細胞。采用半定量積分法判斷HIF-1α蛋白的表達情況。依據染色強度評分：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞<5%為0分，5%≤陽性細胞<25%為1分，25%≤陽性細胞<50%為2分，陽性細胞≥50%為3分。染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)，其中弱陽性(+)、中等陽性(++)及強陽性(+++)均為陽性。

6.觀察指標：比較胃癌組織和正常胃組織中HIF-1α蛋白的表達情況，比較不同臨床特征胃癌病人胃癌組織中HIF-1α蛋白的表達情況。隨訪3年，第1次入院便開始隨訪，第1年每3個月隨訪1次，以后2年每6個月隨訪1次。統計病人生存情況。病人總生存期是指對病人進行隨訪期間病人死亡或者隨訪結束。比較胃癌組織中HIF-1α蛋白陽性表達和陰性表達病人的生存率。根據隨訪情況，將病人分為生存組與死亡組，比較兩組病人胃癌組織中HIF-1α蛋白的表達情況。分析胃癌組織中HIF-1α蛋白表達情況與胃癌病人臨床特征及預后的相關性。

三、統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，采用Graphad Prism 5.0軟件作圖。HIF-1α蛋白以及DNA甲基化的表達水平采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson法；對數秩和檢驗(Log-rank)分析組間生存率差異。檢驗水準雙側α=0.05。

結果

1.HIF-α的mRNA表達水平與DNA甲基化水平：HIF-1α在胃癌組織中的表達及DNA甲基化情況與癌旁組織相比，HIF-1α在胃癌組織中的表達水平較低，癌旁組織與癌組織的表達量分別為(4.80±0.29)和(3.09±0.09)，差異有統計學意義(t=5.369，P<0.05)(圖1，表1)，而其中DNA甲基化水平則偏高，正常與癌組織的表達量分別為(0.158±0.010)和(0.362±0.009)，差異有統計學意義(t=6.806，P<0.05)(圖2，表1)。說明DNA甲基化水平與癌組織的擴散轉移具有密切關系。再通過Pearson分析法分析HIF-1α蛋白表達與其DNA甲基化水平之間的相關性，發現二者呈負相關關系(r=-0.46，P<0.05)(圖3)。結果表明，胃癌中HIF-1α表達下降，推測應該與其DNA甲基化水平升高具有一定的相關性，同時，HIF-1α的表達與DNA甲基化水平的表達水平的高低在臨床方面可以體現出腫瘤的侵襲程度。

圖1 HIF-1α在癌旁組織和胃癌組織中的mRNA表達水平

圖2 HIF-1α在癌旁組織和胃癌組織中的DNA甲基化水平

圖3 HIF-1α的表達水平與DNA甲基化表達水平的關系

表1 HIF-1α與DNA甲基化水平在胃癌組織和癌旁組織中的表達

2.胃癌組織和癌旁組織中HIF-1α因子表達情況的比較：免疫組化結果顯示HIF-1α因子主要定位于胃細胞核及核周，呈棕色顆粒狀或灶性分布;胃癌組織大部分能被染色，癌旁組織只有少部分被染色，且胃癌組織胃細胞均著色較深，呈深棕色。提示胃癌組織中HIF-1α因子的表達量均高于癌旁組織。在所收集的62例胃腺癌組織和癌旁組織中，與癌旁組織相比，有70．97%(44 /62)胃癌組織存在不同程度的HIF-1α因子表達水平的上調。

3.不同臨床特征胃癌病人胃癌組織中HIF-1α因子表達情況的比較：對免疫組化結果進行統計，結果顯示，62例胃癌病例的胃癌組織中HIF-1α因子的表達水平與病人的年齡及性別無顯著性相關(P>0.05)，但是與腫瘤直徑和胃癌不同的發病部位以及TNM分期有顯著相關(P<0.05)。HIF-1α因子表達率的越高，腫瘤越大，并且HIF-1α因子在胃體部腫瘤的高表達率要顯著高于胃竇和賁門(表2)。以上結果提示HIF-1α因子在胃癌組織中的表達對腫瘤的發展、浸潤程度有促進作用，并且在不同部位的胃癌中可能存在表達差異。

表2 HIF-1αmRNA的表達與胃癌臨床病理特征的關系

4.HIF-1α表達與胃癌病人預后的相關性：62例病人均獲得隨訪資料。本研究將胃癌病人分為HIF-1α高表達組和低表達組；采用Kaplan-Meier法繪制總生存曲線及無復發生存曲線；對數秩和檢驗(Log-rank)分別比較HIF-1α高表達組和低表達組的總生存率和無復發生存率。結果表明，HIF-1α低表達組的總生存率(HR=0.601，P=0.002)(圖4)和無復發生存率(HR=0.498，P=0.003)(圖5)均顯著高于HIF-1α高表達組。結果顯示，HIF-1α高表達可以作為胃癌病人的不良預后的參考指標。

圖4 HIF-1α高表達組和低表達組的總生存率

圖5 HIF-1α高表達組和低表達組的無復發生率

討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，在腫瘤惡化的過程中耗氧量比較大，腫瘤組織處于缺氧狀態，而HIF-1α對其有一定的調節功能[14]。本研究結果表明，胃癌組中HIF-1α基因表達量高于癌旁組織，所以在臨床方面可以通過HIF-1α的表達水平來推測出腫瘤的侵襲程度[15-18]。有研究表明，腫瘤局部浸潤和淋巴結轉移離不開低氧微環境的作用。普遍認為，低氧微環境是腫瘤生長的最終結果。以低氧調控因子為代表，可通過調控血管生成、免疫應答和糖酵解等信號，使得在低氧微環境中腫瘤細胞侵襲及轉移能力提高，并對放化療產生抵抗作用。也有研究表明，低氧條件下存在小部分低氧誘導蛋白可以抑制腫瘤生長[19-20]。

免疫組化結果顯示，HIF-1α主要定位于胃細胞核及核周，相比于癌旁組織的表達量較大，對免疫組化結果進行統計顯示，胃癌組織中HIF-1α的表達水平與病人的年齡及性別無明顯相關，但是與腫瘤直徑和胃癌不同的發病部位有顯著相關。HIF-1α蛋白表達率越高，腫瘤越大，并且HIF-1α在胃體部腫瘤的高表達率要顯著高于胃竇和賁門。以上結果提示，HIF-1α在胃癌組織中的表達對腫瘤的發展、浸潤程度有促進作用，并且在不同部位的胃癌中可能存在表達差異。

由于選擇樣本數量較小，參照bootstrap方法檢驗統計是否顯著，需要根據bootstrap方法得到的95%置信區間來判斷。本研究結果表明，HIF-1α在胃癌組織和癌旁組織比較，差異有統計學意義，兩者間DNA甲基化水平比較，差異有統計學意義。分析HIF-1α表達與其DNA甲基化水平的相關性發現，二者呈負相關關系，由此推測，HIF-1α表達降低，可能與其DNA甲基化水平升高有關。通過ROC曲線分析可知，HIF-1α高表達可預示胃癌病人不良預后,還可以判斷出腫瘤的發展以及浸潤程度。

有研究表明，在腫瘤細胞的擴散及血管形成中HIF-1α發揮著重要的作用，HIF-1α的高表達與腫瘤的惡化還有淋巴結的轉移有密切關聯。對病人近3年的觀察表明，胃癌病人HIF-α高表達者生存率為79.8%，而HIF-1α低表達者生存率僅為56.2%，低表達率病人明顯生存率偏高。臨床研究還發現，在幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)相關胃炎和胃腺癌中檢測HIF-1α的表達發現，在正常胃黏膜中HIF-1α不表達，而由HP相關胃炎轉變成胃癌的胃黏膜中，HIF-1α的染色強度增強，密度增加。這表明胃癌的演變可能伴隨著HIF-α的參與。伴隨胃癌演變的惡劣，HIF-1α的表達也在不斷增加，同時，HIF-1α在胃癌中的表達提高，也會加劇胃癌的惡化程度。因此，對HIF-1α的表達進行檢測可以幫助了解胃癌的的發展程度，對預后的判斷可以提供有效的參考價值。

綜上所述，HIF-1α在人體的不同種類腫瘤細胞中都有表達，在維持腫瘤細胞的代謝過程、腫瘤血管的形成、還有促進腫瘤細胞轉移擴散中扮演著重要的角色。并且在胃癌組織中高表達，可能會加速胃癌擴散轉移，可以作為治療腫瘤的一項參考指標，同時對病人的預后也可以提供有效的參考價值。所以，研究HIF-1α對研究腫瘤轉移擴散、以及治療方案還有對胃癌病人的預后判斷等方面具有良好意義。