肝動脈結扎聯合門靜脈部分阻斷對肝再生及肝細胞癌生長的影響

潘樂玉 郭德良 張玉仙 楊衛華 王志剛

根治性肝切除術是肝癌的首選治療方式，但由于受術后殘肝體積的限制，僅約30%的病人適合手術治療[1]。有學者先后提出以下策略：(1)門靜脈結扎(portal vein ligation，PVL)前行肝動脈介入栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)后2～4周再行肝腫瘤切除，臨床研究提示此策略能促進保留側肝臟再生，抑制腫瘤生長。但病人需經歷2次有創操作，且二期手術前治療周期較長(約8～16周)。(2)聯合肝臟離斷和門靜脈結扎二步肝切除(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS)，ALPPS是一種全新的手術方式，為那些因為余肝體積不足無法行根治性手術切除的病人帶來了福音，但 ALPPS 的復雜性及術后高并發癥發生率(36.0%～64.0%)及死亡率(9.0%～28.7%)使其開展及應用受限[2-3]。接受ALPPS的病人需經受2次手術打擊，對病人心理和生理均是巨大考驗。我們以裸鼠為實驗對象，結扎患側肝動脈(hepatic artery ligation,HAL)并部分阻斷患側門靜脈血流(partial portal vein ligation,pPVL)，觀察保留側肝臟增生及腫瘤生長情況。

材料與方法

一、材料

2018年9月～2018年12月，取健康4周齡裸鼠，體質量(22.3±1.8)g SPF級，由武漢大學動物實驗中心提供。手術器械購自上海醫療器械(集團)有限公司，麻醉藥物戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒和石蠟切片膠原纖維(Masson)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

二、方法

圖中實體黑線代表部分阻斷門靜脈用的針頭，空芯箭頭表示門靜脈部分阻斷的部位。對門靜脈及動脈做相應處理后，肝右中葉、左內葉及左外葉的沒有肝動脈供血，門靜脈供血將減少

1.建立裸鼠肝細胞肝癌模型 ：方法如下：(1)選取1只裸鼠，麻醉后酒精消毒腋下皮膚，用1 ml注射器將濃度為107/ml鼠肝癌細胞系Hepa1-6懸液0.1 ml注射至裸鼠腋下皮下組織內，4周后成瘤大小約1.5 cm×1.5 cm，麻醉處死裸鼠后，完整取出腫瘤，用剪刀將腫瘤剪成大小約1 mm×1 mm瘤塊，置于生理鹽水中備用。(2) 裸鼠麻醉后，正中切口開腹，以18G套管穿刺針，用顯微鑷將一小瘤塊經套管針針尖處送至管腔內。(3) 穿刺肝左外葉至被膜下肝實質深約3～5 mm，置入針芯并緩慢推送瘤塊至肝實質內，拔出穿刺針未見腫瘤塊脫出，證實穿刺成功，關腹。約2周后肝左外葉接種處成瘤，大小約0.7 cm×0.5 cm。

2.實驗分組：建模成功后的肝細胞肝癌裸鼠120只隨機分4組：空白對照組(Sham,A組)、肝動脈結扎組(HAL，B組)、部分門靜脈限流組(pPVL，C組)、肝動脈結扎聯合部分門靜脈限流組(HAL+pPVL，D組)，每組各30只。(1)A組：開腹后僅對擬處理側門靜脈及肝動脈進行游離后關腹。(2)C組:開腹后，自肝右上葉、右下葉與尾葉上方游離供應肝中葉、左內葉及左外葉的門脈及肝動脈主干，對門靜脈及動脈做相應處理后，肝右中葉、左內葉及左外葉的沒有肝動脈供血，門靜脈供血將減少，處理肝葉約占總肝重的 78%(圖1)。用實時超聲波測量此時供應肝中、左內葉及左外葉的門脈及肝動脈主干血流(ml/min)作為基線值。采用Yokoyama等[4]的方法實施pPVL，應用0.25 mm針頭與門靜脈并行捆綁7-0絲線確切結扎(裸鼠的門靜脈直徑約1.0～1.5 mm)，將針頭抽出以實現部分阻斷門靜脈血流。操作過程中結合術中超聲(GE Logic E9，美國)檢測血流量，以更準確地控制阻斷程度及確保門靜脈通暢。限流成功5分鐘后，超聲波檢測預處理側肝動脈血流變化，關腹。

3.標本留取：術后24小時、72小時、1周、2周、3周留取標本，A組及各實驗組每時間點6只，處死C組及D組裸鼠前采用彩超了解小鼠結扎側門靜脈通暢情況。麻醉成功后，5 ml注射器于下腔靜脈留取血標本后處死裸鼠，剪取保留側肝組織，分別稱重保留側肝臟組織，測量腫瘤最大徑(a)、最小徑(b)。10%福爾馬林溶液固定后常規制作蠟塊。血液標本離心后(3 000轉/分鐘、10分鐘)留取上清液血漿。

4.標本檢測：組織切片后常規行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組各肝葉組織病理學改變。用全自動生化分析儀檢測血漿中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、白蛋白(ALB) 總膽紅素(TBIL)濃度，組間對上述實驗結果統計分析。

5.裸鼠保留側肝臟重量測定及再生率計算：各組裸鼠術后各時點未接扎肝再生率(HRR)=(WA-WI)/WI×100%。其中WA和W1分別代表裸鼠處死時測定的保留側肝實際重量及假手術組對應肝葉的平均重量。

6.肝臟腫瘤體積測定：測量肝臟移植瘤最長徑(a)和最短徑(b),計算腫瘤體積V=ab2/2[5]。

7.微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)標本取材方案：參照七點基線取材方案,分別在腫瘤標本的12點(A點)、3點(B點)、6點(C點)和9點(D點)方位上癌旁肝組織交界處按取材，重點觀察腫瘤對包膜、血管以及鄰近肝組織的侵犯方式和累及范圍；在顯微鏡下于內皮細胞襯覆的血管腔內見到癌細胞巢團，判定 MVI陽性。

三、統計學處理

結 果

D組1只裸鼠因門靜脈血栓急性形成，術后72小時內死亡，C組1只裸鼠因腹腔出血，在術后24小時內死亡。

1.血清生化指標檢測：ALT及AST濃度水平在術后24小時及72小時，C組及D組與A組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，在術后1周，2周，3周差異無統計學意義。B組比A組在各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)。C組及D組在各時間點比較差異無統計學意義，各組間ALB比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表1、表2)。TBIL在D組術后24小時比A組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，在術后72小時、1周、2周及3周，差異無統計學意義，B組與A組在各時間點比較，差異無統計學意義(表1、表2)。

表1 不同手術方式在術后不同時間段各臨床指標

2.保留側肝臟增生率測定 :C組及D組保留側肝臟質量(尾狀葉，右上葉及右下葉)增加與A組及B組在術后72小時，1周，2周，3周差異有統計學意義(P<0.05)。C組與D組保留側肝臟質量比較差異無統計學意義(P>0.05)，B組與A組保留側肝臟質量比較差異無統計學意義(P>0.05)(表1、表2)。

3.各組裸鼠肝臟腫瘤大小測定：HAL組及D組腫瘤大小與C組及A組在術后1周，2周及3周比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B組與D組腫瘤大小無差異，C組與A組腫瘤大小無差異(表1、表2)。

表2 各臨床指標在術后不同時間段不同手術方式的統計檢驗

4.MVI測定：將A組與C組合并為參照組共12例，B組與D組合并為實驗組共12例。參照組在術后24小時、72小時、1周、2周及3周 MVI陽性率小鼠個數分別為0、0、0、3及0只。實驗組在術后24小時、72小時、1周、2周及3周 MVI陽性率小鼠個數分別為0、1、1、1及6只。實驗組與對照組術后2周及3周MVI陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，并且術后累積MVI例數與未MVI例數比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

討論

手術切除腫瘤是肝臟原發性和繼發性腫瘤根治性治療的主要方式，但對于剩余肝臟體積過小，無法耐受大范圍肝切除術的病人，只能接受姑息性非手術治療，療效往往不盡如人意[6]。

pPVL可促進保留側肝臟的代償性增生，增加手術后保留側肝臟體積，使部分病人重新獲得手術治療的機會[7]。但術前pPVL在誘導保留側肝再生的同時會促進患側腫瘤生長[8]。對肝癌大鼠部分門靜脈結扎后發現，在誘導保留側肝再生的同時會促進患側腫瘤生長[9-10]。本實驗中也看到，盡管C組腫瘤增大與A組比較無統計學意義，但與B組及D組比較差異有統計學意義。因此，僅行PVL或pPVL在等待殘肝代償增生的階段，腫瘤可能進展至保留側肝葉內(尤其是腫瘤位置靠近保留側的肝葉時)或侵犯至肝內較大血管分支，甚至轉移至肝外，使預期的二期肝切除術無法實施。

pPVL促使患側腫瘤生長可能與肝臟血流動力學的改變相關[11]。pPVL患側肝葉肝動脈血流反射性增加(肝動脈Buffer效應)，促使以肝動脈供血為主的肝癌進展。在本實驗中，B組及D組腫瘤大小與C組及A組比較有統計學意義，說明結扎肝臟動脈后，肝臟腫瘤血供減少，生長減慢。

HAL的主要抗癌機制是腫瘤“去血供”導致缺氧,殺傷多數腫瘤細胞,抑制其生長,但缺氧作為一種篩選手段,賦予耐受缺氧的腫瘤細胞更強的侵襲、轉移潛能[12-14]。為探討肝動脈結扎對腫瘤侵襲性的影響，因實驗裸鼠數量有限，我們將A組與C組合并為對照組，B組與D組合并為實驗組，兩組術后3周MVI陽性率比較，差異有統計學意義，說明肝動脈結扎可以促進腫瘤轉移，隨著時間延長，腫瘤細胞肝內及遠處轉移風險增大。本實驗結果表明，實驗組術后3周與術后2周 MVI陽性率比較差異有統計學意義。因此，D等待肝臟增生時間應在兩周以內為佳，過長的等待時間預示預后不良。

該實驗建立裸鼠實驗模型，盡管ALT及AST在C組及D組術后24小時及72小時比A組明顯升高，但在術后1周明顯下降，且與A組比較，差異無統計學意義，說明HAL+pPVL對肝臟細胞的損傷是可逆的。

D組1只裸鼠因門靜脈血栓急性形成在術后72小時內死亡。因裸鼠的結扎側肝動脈結扎，門靜脈急性血栓形成可導致肝臟組織壞死感染，導致嚴重后果，提示圍手術期抗凝是必要的。

本實驗結果表明，HAL+pPVL可以促進保留側肝臟代償增生，同時在一定時間內抑制腫瘤的生長，為部分晚期肝癌病人診斷提供了新的治療思路。但裸鼠缺少免疫系統且沒有肝纖維化背景，因此其部分結論推廣至人類，尚需進一步的深入研究。