基于NF-κB通路研究槲皮素對心肌缺血再灌注損傷大鼠的影響*

何亞磊，蔡葉銳，魏引，張金盈

1.云南省第三人民醫院，云南 昆明 650011；2.鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052

缺血性心肌病是常見且危害較重的疾病之一，臨床多采用冠脈介入、溶栓及動脈搭橋等治療，以恢復缺血區心肌的血液供應，減少心肌梗死［1］。臨床研究發現，發生心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）時，心肌組織存在炎性浸潤、心肌細胞大量死亡及氧化應激等，進一步加重了心肌功能障礙和結構損傷。因此，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者術后減少MIRI對保護缺血心肌有重要的臨床意義［2］。研究顯示，減輕MIRI過程中的氧化應激及炎癥反應可有效緩解冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者術后心肌損傷。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗高血壓及抗動脈粥樣硬化作用［3］。研究顯示，槲皮素預處理可保護脂多糖誘導的小鼠急性腎損傷［4］，可抑制糖尿病大鼠心肌炎癥小體的活性，降低炎癥水平，改善糖尿病性心肌損傷［5］。同時，槲皮素還可改善H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷模型中細胞的損傷及凋亡［6］，但未見其對MIRI大鼠模型的相關研究。因此，本研究擬建立大鼠MIRI模型，以期從核轉錄因子kappa B（nuclear factor of kappa B，NF-κB）通路角度揭示槲皮素防治心肌梗死的作用及機制。

1 材料

1.1 動物85只SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，體質量180～250 g，購自北京維通利華生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-2-006。

1.2 藥物與試劑槲皮素（質量分數≥98%，國藥集團化學試劑有限公司，批號：C09S8Y53412）。白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（中國碧云天公司，批號分別為：20180413、20180309、20180506）；乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶MB（creatine Kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司，貨號分別為：bsk00031、bsk00121、bsk00015）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、超微量ATP酶（Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP）試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司，批號分別為：20180112、20180307）；兔抗鼠κB抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear factorκB kinase，IKK）、IκBα、NF-κB多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號分別為：ab151543、ab6752、ab14356）。

1.3 儀器SH11/YF-9型光學顯微鏡（日本Olypmus公司）；Genios多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；ChemiDoc TM XRS+凝膠成像儀器（美國Bio-Rad公司）；RM6240型超聲心動儀（日本Olypmus公司）。

2 方法

2.1 MIRI大鼠模型制備與分組將85只雄性大鼠按體質量隨機分為5組：假手術組、模型組及槲皮素低、中、高劑量（25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1）組，每組17只，模型組及槲皮素各劑量組均建立MIRI模型。大鼠禁食不禁水12 h，給予10%烏拉坦麻醉，仰臥位固定，氣管連接呼吸機，標準肢體Ⅱ導聯實測心電圖。75%乙醇左胸部消毒，剪開胸部，暴露心臟及表面血管，插入線栓造成心臟缺血30 min，剪開結扎線再灌注40 min建立MIRI模型［7-8］，其中假手術組僅分離前降支，不結扎。以收緊結扎線后大鼠的標準導聯心電圖ST-T段抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上為MIRI模型建立成功。各組給予相應的藥物，假手術組及模型組則給予同體積生理鹽水，連續給藥7 d。

2.2 檢測指標

2.2.1 測定大鼠心臟功能于末次給藥12 h后，采用超聲心動儀檢測大鼠左心功能，記錄左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

2.2.2 觀察大鼠心臟病理學及心梗死面積百分比變化心臟功能測定完成后，每組隨機選3只大鼠，摘除心臟，用10%福爾馬林固定，蠟塊包埋后并切片，行HE染色，在光鏡下觀察病理學變化［9］。每組隨機選3只大鼠，取心臟，-20℃冷凍30 min后，行TTC染色，正常心肌組織呈紅色、梗死區呈灰白色。采用Image J軟件計算心肌組織梗死面積百分比。

2.2.3 檢測大鼠的心肌損傷指標每組隨機選8只大鼠腹主動脈取血，室溫靜置20 min，2 000 r·min-1離心10 min后，檢測血清中LDH及CK-MB水平。

2.2.4 檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平檢測上述大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.2.5 檢測心肌組織中SOD、MDA及Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP酶活力將取血后的8只大鼠，取心臟，制備10%心肌組織勻漿（心肌組織∶生理鹽水＝1∶9），4℃、4 000 r·min-1離心10 min，抽取組織上清液，測定MDA、SOD及超微量ATP酶（Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP）活力。

2.2.6 檢測大鼠心肌組織NF-κB通路相關蛋白表達水平每組隨機選取3只大鼠，取左心室心肌組織，剪碎后加入RIPA組織裂解液，裂解20 min，10 000 r·min-1離心20 min，取上清，測定蛋白濃度，并變性。取各組蛋白上樣，于12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳后，電轉至硝酸纖維膜，加入p-IκBα、p-IKK、p-NF-κB p65及IκBα、IKK、NF-κB p65和β-actin一抗（1∶1 000）、辣根過氧化物酶標記鼠抗兔二抗（1∶2 000），化學底物發光法顯色，圖像掃描分析。顯影的條帶采用Image-QuaNT軟件測量其灰度值，用目標蛋白與β-actin灰度值的比值表示蛋白表達［10］。

2.3 統計學方法用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用One-Way ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 槲皮素對MIRI模型大鼠心功能的影響與假手術組比較，模型組LVEF、LVFS均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組LVEF、LVFS均顯著升高（P＜0.01），槲皮素低劑量組LVEF、LVFS均明顯升高（P＜0.05）。提示槲皮素可明顯增強MIRI大鼠的心肌收縮力，改善心臟功能。見表1。

表1 槲皮素對MIRI模型大鼠心功能的影響 （±s）

表1 槲皮素對MIRI模型大鼠心功能的影響 （±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

LVEF/% LVFS/%假手術組組別 n 17 88.42±4.41 58.76±4.81模型組 17 52.17±3.47** 33.29±3.19**槲皮素低劑量組17 58.28±4.41＃ 38.37±2.28＃槲皮素中劑量組17 67.67±3.89＃＃ 44.46±3.82＃＃槲皮素高劑量組17 79.29±4.47＃＃ 52.65±2.68＃＃

3.2 槲皮素對MIRI模型大鼠心臟病理學及心臟梗死面積百分比的影響假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，無纖維斷裂及炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌纖維結構雜亂，存在心肌纖維斷裂及炎性浸潤；槲皮素低、中、高劑量組大鼠心肌組織中炎癥細胞明顯減少，心肌損傷得到顯著緩解。見圖1。

圖1 槲皮素對MIRI模型大鼠心臟病理學的影響（HE）

與假手術組比較，模型組大鼠心臟梗死面積百分比顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組大鼠心臟梗死面積百分比均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），槲皮素低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。提示槲皮素可顯著改善MIRI大鼠造成的炎癥浸潤及心肌梗死損傷。見表2、圖2。

圖2 槲皮素對MIRI模型大鼠心臟梗死面積百分比的影響（TTC）

表2 槲皮素對MIRI模型大鼠心臟梗死面積百分比的影響 （±s）

表2 槲皮素對MIRI模型大鼠心臟梗死面積百分比的影響 （±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

/%假手術組組別 n 心肌梗死面積百分比3.31±1.27模型組 3 48.26±5.47**槲皮素低劑量組 3 45.28±4.64槲皮素中劑量組 3 32.17±3.79＃槲皮素高劑量組 3 20.35±5.03 3＃＃

3.3 槲皮素對MIRI模型大鼠血清炎癥因子水平影響與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；槲皮素低劑量組的IL-1β、IL-6水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α水平無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，ng·L-1）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 n IL-6 IL-1β TNF-α 8 33.26±4.02 220.48±14.89 1.25±0.31模型組 8 76.64±6.58**401.86±42.64** 3.28±0.51*槲皮素低劑量組 8 68.18±3.46＃ 350.68±21.39＃＃ 3.18±0.28槲皮素中劑量組 8 55.48±4.42＃ 296.29±23.85＃＃ 2.39±0.42＃槲皮素高劑量組 8 40.21±3.67＃ 248.49±16.88＃＃ 1.68±0.34假手術組＃

3.4 槲皮素對MIRI大鼠心肌損傷標志物及自由基氧化損傷標志物的影響與假手術組比較，模型組大鼠血清中LDH及CK-MB水平均顯著升高（P＜0.01），心肌組織中SOD活性顯著降低（P＜0.01）、MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組大鼠血清中LDH、CK-MB水平顯著降低（P＜0.01），心肌組織中SOD活性顯著升高（P＜0.01）、MDA水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠心肌損傷標志物及自由基氧化損傷標志物的比較 （±s）

表4 各組大鼠心肌損傷標志物及自由基氧化損傷標志物的比較 （±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 n LDH/U·L-1 CK-MB/U·L-1 SOD/kU·g-1 MDA/mol·g-1±1.22模型組 8 417.81±56.73** 150.86±12.65** 79.65±9.26** 17.28±2.01**槲皮素低劑量組 8 320.51±32.81＃＃ 102.76±14.49＃＃ 90.71±7.96＃＃ 13.76±1.79＃槲皮素中劑量組 8 268.48±27.94＃＃ 78.97±8.71＃＃ 128.79±9.95＃＃ 9.96±1.36＃槲皮素高劑量組 8 189.72±31.75＃＃ 56.98±7.67＃＃ 150.66±11.21＃＃ 7.79±1.17假手術組 8 141.32±22.46 42.52±7.62 189.31±15.78 6.62＃＃

3.5 槲皮素對MIRI大鼠心肌超微量ATP酶活力的影響與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力均明顯升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠心肌組織Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力的比較 （±s）

表5 各組大鼠心肌組織Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力的比較 （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n Na+-K+-ATP/U·mgprot-1 Ca2+-ATP/U·mgprot-1 8 8.44±1.69 0.26±0.02模型組 8 5.12±1.37* 0.11±0.01*槲皮素低劑量組 8 7.32±1.58＃ 0.31±0.04＃槲皮素中劑量組 8 10.24±2.79＃ 0.34±0.05＃槲皮素高劑量組 8 11.18±2.57＃ 0.46±0.07假手術組＃

3.6 槲皮素對MIRI大鼠心肌組織NF-κB通路相關蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠心 肌 組 織 中p-IκBα/IκBα、p-IKK/IKK及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素各劑量組心肌組織中p-IκBα/IκBα、p-IKK/IKK及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均顯著降低（P＜0.01）。見表6、圖3。

表6 各組大鼠心肌組織NF-κB通路相關蛋白表達的比較 （±s）

表6 各組大鼠心肌組織NF-κB通路相關蛋白表達的比較 （±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01

組別 n p-IKK/IKK p-IκBα/IκBα p-NF-κBp65/NF-κ Bp65假手術組3 0.34±0.01 0.16±0.02 0.12±0.01模型組 3 6.63±0.52**5.78±0.43** 6.02±0.49**槲皮素低劑量組 3 4.44±0.31＃＃3.66±0.34＃＃ 4.17±0.33＃＃槲皮素中劑量組 3 2.68±0.26＃＃2.28±0.17＃＃ 3.05±0.26＃＃槲皮素高劑量組 3 1.33±0.08＃＃0.97±0.04＃＃ 1.19±0.11＃＃

圖3 槲皮素對MIRI大鼠心肌組織NF-κB通路相關蛋白表達圖

4 討論

缺血性心肌病為近年來居民急性死亡的主要原因之一，其治療過程的缺血再灌注會進一步加重心肌功能障礙和結構損傷［10］。槲皮素為黃酮類化合物，具有抗高血壓、抗氧化應激損傷及改善內皮功能等作用［3］。在構建的H9c2心肌細胞缺氧復氧模型中，槲皮素能明顯降低缺氧復氧后心肌細胞LDH及NO的釋放，減少心肌細胞損傷及凋亡［11］。

本研究發現，槲皮素可明顯增強MIRI大鼠的心肌收縮力，改善心臟功能，有效減輕心肌組織炎癥反應和心肌細胞水腫，改善心肌梗死面積百分比。提示槲皮素對MIRI模型大鼠具有明顯的保護作用，且隨著槲皮素劑量的增加，其保護作用愈加明顯。另有研究顯示，槲皮素還可減輕壓力超負荷大鼠左心室肥厚程度及心肌纖維化程度［12］。CK-MB和LDH為檢測心臟疾病的經典生物標志物，當心肌細胞損傷時，心肌通透性增加，兩者由胞質釋放到細胞外，因此兩者在血清中的濃度越高，心肌損傷越嚴重［13-14］。槲皮素干預后可明顯降低大鼠血清中CK-MB、LDH水平，這反映槲皮素可改善MIRI模型大鼠的心肌損傷。

研究表明，心肌MIRI與炎癥反應、氧自由基的過量產生有密切關聯［15］。IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子，能促進心肌組織炎性浸潤，刺激其他炎癥因子表達，加劇心肌炎癥反應［16-17］。研究表明，槲皮素對卵清蛋白誘導的小鼠支氣管哮喘具有明顯的抗炎作用［18］，對上述促炎癥因子同樣有顯著影響。本研究發現，槲皮素可明顯降低MIRI模型大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α水平，提示槲皮素可顯著改善MIRI誘導的炎癥反應，且隨槲皮素劑量的增加其抗炎作用愈加明顯。

SOD是氧化應激誘導的內源性自由基清除酶，其在預防缺血再灌注期間氧化應激損傷中有關鍵作用；MDA是氧自由基與細胞膜脂質的氧化產物，其水平越高表示氧化損傷越嚴重，兩者均為評估心肌氧化應激水平的指標［19-20］。本研究發現，槲皮素可使MIRI模型大鼠心肌組織中SOD活性升高，MDA水平顯著降低，表明其可通過清除氧自由基、增強心肌抗氧化酶活性來減少外周血中心肌酶含量，從而緩解MIRI造成的心肌組織損傷。

當MIRI誘導心肌損傷時，可出現心肌細胞的過度收縮和線粒體通透性轉換孔開放，出現線粒體鈣超載和細胞內鈣超載，而Ca2+-ATP及Na+-K+-ATP兩種超微量ATP酶為維持心肌細胞內離子穩態的重要物質，抑制兩種酶的活性可使Ca2+轉運能力下降，出現細胞內鈣超載［21-23］。在本研究中，MIRI模型大鼠心肌組織Ca2+-ATP及Na+-K+-ATP酶活力降低，而槲皮素可顯著增加超微量ATP酶活力，使Ca2+外排，降低心肌細胞內Ca2+含量，避免心肌細胞內鈣超載，從而減少MIRI誘導的氧化應激損傷。

研究顯示，NF-κB p65蛋白及其抑制性蛋白IkBα在炎癥反應、細胞凋亡中發揮著重要的作用。MIRI誘導的氧化應激反應除了能直接發揮細胞毒性作用外，還能作為信號分子調控某些相關基因的表達，其中NF-κB通路的活化是氧化應激的主要作用靶點［24-25］。本研究發現，槲皮素可顯著抑制p-IκBα、p-IKK及NF-κB p65水平，表明槲皮素可顯著抑制MIRI大鼠NF-κB通路的激活，從而減輕氧化應激造成的心臟損傷。

綜上所述，槲皮素可顯著減輕MIRI引起的心肌損傷，改善心臟功能，抑制心肌組織炎癥反應和氧化應激反應，其作用機制可能與增強超微量ATP酶活力及抑制NF-κB通路有關。