巨噬細胞炎癥蛋白-1ɑ拮抗劑聯合硼替佐米通過抑制Erk1/2/Bax促進骨髓瘤骨病成骨的作用

陳衛瓊 蔣芳 王姍姍 黃勃 屈付君 黃林 王曉桃

桂林醫學院第二附屬醫院（廣西桂林541100）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種B 細胞惡性腫瘤，溶骨性破壞是其主要表現之一［1］。骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD）的發生機制是破骨細胞（osteoclast，OC）活性增加，成骨細胞（osteoblast，OB）活性受抑制，導致骨吸收和骨形成平衡失調［2］。研究發現巨噬細胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein 1-α，MIP-1α）、白介素（interleukin，IL）-6 和骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）等在內的多種破骨細胞活化因子影響OC 分化［3-5］。本團隊前期研究發現MIP-1α與MBD關系密切，目前MIP-1α在MBD 發生中的作用，主要集中在OC 的激活［3］。研究發現，MIP-1α也有抑制OB 的作用，但其抑制OB 的特點不明確［3，5］。有文獻報道，骨髓瘤中瘤細胞分泌的MIP-1α可促使G 蛋白Ras 和Rho 異戊稀化，從而導致MM 患者骨髓中的Rho 亞家族蛋白A（Ras homologueA，RhoA）水平增高，RhoA 與其下游的效應蛋白Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho-associated coild-protein kinas，ROCK1）相互作用參與細胞增殖和轉錄活性［6-8］，且前期研究發現在MM 患者中RhoA/ROCK1 高表達［9］。活化的RhoA/ROCK1 可以激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，Erk），而Erkl/2 與其有同源結構域，Erkl/2 的作用底物是Bax，Erkl/2 活化后上調Bax，啟動凋亡信號通路，最終引起OB 凋亡［3］。目前國內外針對MIP-1α是否通過Erk1/2/Bax 影響成骨作用未見相關報道。

硼替佐米（bortezomib，Bor）在臨床上常用于MBD 患者［10］。有報道發現，Bor 可通過APRIL-NFkB 通路抑制MIP-1α［11］。基于此，本研究通過構建MBD 小鼠模型，在給予MIP-1α拮抗劑干預后，檢測小鼠骨質破壞嚴重程度并評估OB 和OC 功能狀態及相關蛋白表達，以此來探討MIP-1α拮抗劑聯合Bor 是否抑制Erk1/2/Bax 通路影響MBD 成骨作用及MIP-1α拮抗劑與Bor 聯合治療是否具有協同作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料RPMI1640 培養（美國Gibco 公司）；胎牛血清（美國Gemini 公司）；裂解液（北京索來寶公司）；PVDF 膜（Millipore 公司）；ECL 發光試劑盒、山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠的二抗、β-actin（北京中杉）；一抗：ERK、BAX、Caspase-3、Caspase-9（ABCAM）；ELISA 試劑盒：sRANKL、BALP、OPG、SOST、MIP-1α、IL-6（CUSABIO）；CD138+抗體、免疫組化抗原修復緩沖液（福州邁新生物技術開發有限公司）；硼替佐米、Bx471（美國MCE 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養MM IM-9 細胞株培養于含青霉素與鏈霉素組成的RPMI-1640 培養基中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱，每3～4 天傳代。

1.2.2 MBD 小鼠局部成瘤模型選擇4 ～6 周齡的SCID 小鼠，在上肢接種絕對數1×106個（100 μL瘤細胞懸液）的IM-9 細胞，當皮下移植瘤生長到直徑約15 ～30 mm 時，HE 染色和免疫組化鑒定惡性漿細胞建模成功后，將成瘤小鼠按腹腔給藥分為四組：對照組（0.9%生理鹽水）、Bor 組（Bor 0.5 mg/kg，1、4、8、11 d 共4 次）、Bx471 組（BX471 2 mg/kg，每周2 次，共4 次）、Bor 聯合Bx471 組（Bor 及Bx471，劑量及用法同上）［12-13］。

1.2.3 X 線檢測各組骨損情況給藥結束后4 d，收集靜脈血，處死各組小鼠，俯臥位將小鼠固定，用X 線（型號：FLAT-BYM）檢測骨質破壞情況。

1.2.4 小鼠中RANKL、OPG、BALP、MIP-1α、SOST、IL-6 蛋白及因子含量的測定將上述靜脈血15 000 rpm/15 min 低溫離心，取上清液備用。分離各組上肢瘤組織，沖洗剪碎，將剪碎的組織與對應體積的PBS（按1∶9 的重量體積比）加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨及混勻，最后將勻漿液12 000 rpm/10 min，取上清備用。具體按照ELISA試劑盒說明書步驟進行。

1.2.5 Western blot 檢測信 號 通路Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白質的表達取上述瘤組織上清液，采用BCA 測蛋白濃度。在10%SDSPAGE凝膠上分離等量的蛋白質，然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，封閉后的膜直接放入相應一抗工作液中，孵育，洗膜，將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中，孵育，洗膜。曝光及洗片，以β-actin 表達量作為內參，用Image J 軟件（版本號1.4.3.67，Tanon 公司）測定條帶灰度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 23 軟件進行數據分析，計量資料服從正態分布，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義，GraphPad Prism 6.0 軟件進行數據作圖。

2 結果

2.1 MBD 小鼠病理學及各組骨質破壞影像學特征與正常小鼠（圖1A）相比，成瘤小鼠右上肢出現局部腫大（圖1C）。正常小鼠組織HE 染色切片未見異型細胞，CD138+免疫組化特異染色未見漿細胞（圖1B）。成瘤小鼠皮下瘤組織HE 染色：顯微鏡下可見多處細胞質增大，細胞核偏位排列彌漫密集的異性細胞；CD138+免疫組化特異染色可見多處細胞棕染，鑒定為克隆性漿細胞（圖1D）。X 線顯示，成瘤小鼠（對照組）右上肢出現病理性骨折（圖2B），骨質破壞程度高于正常小鼠（圖2A），經Bor（圖2C）、Bx471（圖2D）及雙藥（圖2E）聯合治療小鼠骨質破壞程度低于對照組。

圖1 MBD 小鼠病理學檢測Fig.1 Pathological detection of MBD mice

圖2 MBD 小鼠骨質破壞影像學特征Fig.2 Imaging features of bone destruction in MBD mice

2.2 MIP-1α拮抗劑聯合硼替佐米可抑制破骨作用而促進成骨作用結果顯示，對照組的MIP-1α、SOST、RANKL、IL-6 水平高于Bor 及Bx471 組（P＜0.05），且明顯高于Bor+Bx471 組（P＜0.000 5），而OPG、BALP 的表達明顯低于Bor+Bx471 組（P＜0.000 5）。見表1、圖3。

圖3 各組小鼠中MIP-1α、SOST、IL-6、BALP、RANK、OPG 蛋白表達水平Fig.3 Relative expression levels of MIP-1α，SOST，IL-6，BALP，RANK and OPG in each group of mice

表1 不同組別中MIP-1α、SOST、IL-6、BALP、RANK、OPG 因子及蛋白表達水平Tab.1 Relative expression of factors and protein expression levels of MIP-1α，SOST，IL-6，BALP，RANK and OPG in different groups ±s

表1 不同組別中MIP-1α、SOST、IL-6、BALP、RANK、OPG 因子及蛋白表達水平Tab.1 Relative expression of factors and protein expression levels of MIP-1α，SOST，IL-6，BALP，RANK and OPG in different groups ±s

組別Control Bor Bx471 Bor+Bx471 MIP-1（ng/mL）239.9±44.2 169.9±24.7 184.1±23.7 131.2±22.4 IL-6（ng/mL）43.2±6.4 25.6±4.9 29.2±3.8 21.5±3.1 BALP（ng/mL）22.8±8.0 40.1±9.5 39.0±8.0 50.7±6.1 SOST（pg/mL）1 063.6±81.6 511.2±73.2 726.5±119.6 420.1±93.6 RANK（ng/mL）1 601.7±266.7 1 002.2±189.7 999.2±114.1 764.0±182.5 OPG（ng/mL）387.4±154.2 586.7±134.5 550.2±113.7 833.7±146.5

2.3 MIP-1α拮抗劑聯合硼替佐米抑制Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白質的表達結果顯示，對照組的Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白表達高于Bor 組及Bx471 組（P＜0.001），且明顯高于Bor+Bx471 組（P＜0.001）。見圖4。

圖4 各組小鼠中Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白表達水平Fig.4 Protein expression levels of Erkl/2，Bax，Caspase 3，Caspase 9 in each group of mice

3 討論

了解骨髓微環境中細胞相互作用對于開發針對骨髓瘤細胞靶向治療和調節MBD 骨穩態的新型藥物至關重要［1］。本實驗通過抑制MIP-1α產生后，上調OPG 表達，下調RANKL 表達，X 線顯示骨密度增加，同時腫瘤負荷IL-6 表達減少。其機制可能是MIP-1α抑制劑通過抑制某種破骨細胞信號通路，下調的RANKL/OPG 比例，從而阻斷破骨細胞活化及增殖，從而重建骨代謝平衡。在MM 患者的骨髓活檢中發現OB 是受抑制的，并且與腫瘤負荷相關［5］。據報道，瘤細胞超過50%，可抑制OB活性［6］。因此，MIP-1α拮抗劑可能通過減少腫瘤負荷，增強OB 活性［14］。

持續抑制Erk 信號傳導可促進OB 的發展［15-16］。本研究通過抑制MIP-1α產生，Erk1/2、Bax 表達下降，骨質破壞程度改善，可能MIP-1α拮抗劑抑制Erk1/2/Bax 通路促進OB 增殖。MIP-1α主要被認為是破骨細胞活化因子，在骨骼疾病的發病機理中促進分解代謝活性［17］。本實驗結果確定了MIP-1α的新作用，它可能是OB 功能的抑制劑和MM 中OB/OC 解偶聯的介質。同時，經Bor 治療后的小鼠結果與MIP-1α拮抗劑（Bx471）組大致相同，且雙藥聯合效果更為顯著。其可能通過抑制NF-κB 信號通路，下調RANKL/OPG 比例，阻礙破骨細胞活化，重建骨質代謝平衡。有報道發現硼替佐米可通過APRIL-NF-KB 通路抑制MIP-1α表達［11］。因此，Bor 可能通過APRIL-NF-KB 信號通路抑制MIP-1ɑ，從而抑制Erk1/2/Bax 通路，促進OB 增殖。結論有待進一步驗證。

在本實驗中，通過抑制MIP-1α產生，SOST 表達下降。研究發現大部分MBD 患者骨髓的SOST水平與骨質破壞程度相關，同時SOST 與MIP-1α呈正相關［3］。此外，在新診斷MM 患者中發現由SOST 基因編碼的骨硬化蛋白的高水平表達，且與晚期MM 具有相關性［18］。推測可能在晚期MBD 患者中，MIP-1α刺激瘤細胞高表達SOST，兩者相互作用，促進OB凋亡［19-20］。除此之外，經Bor治療后，SOST 下降，這可能是由于Bor 的抗骨髓瘤作用。Bor 下調SOST 的表達揭示了Bor 在逆轉骨髓瘤OB功能中的另一種作用機制［21］。

綜上，MIP-1α拮抗劑聯合Bor 可能通過抑制Erkl/2/Bax/Caspase-3/Caspase-9 通路，從而促進OB增殖及抑制OC 分化，雙藥聯合治療對于MBD 成骨作用效果可能更為顯著。本實驗尚有不足之處，研究所采用的局部成瘤造模方式不能完全模擬MBD 的骨髓微環境和從MM 發展到MBD 的生理病理機制過程。然而，本次實驗將MIP-1α從MBD 復雜的骨髓微環境中抽離出來單獨分析其導致骨質破壞的原因，可以避免其他因子和通路對實驗結果的干擾。但仍需在體外細胞進行下一步驗證。