電針聯(lián)合重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病樣模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)炎癥的影響

陳虹茹 何川 黃重生 王穎 孔立紅

1湖北中藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院（武漢430061）；2武漢市中心醫(yī)院（武漢430015）

隨著老齡化的逐年劇增，老年性癡呆患者數(shù)量大幅度上升，嚴(yán)重影響個(gè)人及其家人的心理健康及生活質(zhì)量，并增加患者家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。阿爾茲海默病（Alzheimer′s disease，AD）又稱作老年性癡呆，是一種腦組織慢性退行性損傷引起的神經(jīng)性疾病，以認(rèn)知和生活行為功能障礙為突出表現(xiàn)［2］。

大量研究證明AD 患者腦組織隨著年齡增長持續(xù)增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)在疾病的病理過程中起著關(guān)鍵作用［3］。目前臨床上治療AD 的西藥主要以膽堿酶抑制劑和氨基酸受體拮抗劑。然而這些藥物有一定的局限性，長期服用費(fèi)用高、患者依從性差，并且具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)［4］。因此，積極尋求安全有效的非藥物治療方法尤為重要。已有大量研究運(yùn)用電針來防治AD，并證明其可抑制腦組織毒性炎癥反應(yīng)，可以有效提高學(xué)習(xí)記憶功能［5］。近幾年出現(xiàn)的新型神經(jīng)電生理技術(shù)-重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS），在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域備受關(guān)注［6］。它通過將電流持續(xù)重復(fù)作用于大腦遠(yuǎn)隔皮層，影響皮層支配區(qū)域神經(jīng)遞質(zhì)與突觸傳遞，改變神經(jīng)元興奮性，促進(jìn)神經(jīng)元突觸修復(fù)和功能重組［7］。但國內(nèi)將電針聯(lián)合rTMS 防治AD 的研究尚在摸索階段，因此本研究利用行為學(xué)等檢測方法來進(jìn)一步深入探討EA聯(lián)合rTMS 對(duì)改善AD 樣模型大鼠認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制和療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組4個(gè)月齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量370 ～390 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2018-0018。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)，光照均勻，自由飲食。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采取隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常組（Normal）、模型組（Model）、電針組（EA）、重復(fù)經(jīng)顱磁組（rTMS）和電針＋經(jīng)顱磁組（EA+rTMS），每組8 只。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑HANS-200A 韓式電針儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），一次性無菌毫針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司），Morris 水迷宮（成都泰盟），石蠟切片機(jī)（廣州三元科技有限公司），電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)：DYY-6C），HT7700 透射電鏡（日本日立公司），重復(fù)經(jīng)顱磁刺激儀（YRD CCY-1 型，武漢依瑞德公司）。Iba-1 一抗、山羊抗兔IgG H&L（Cy3?）、預(yù)吸附二抗（英國Abcam），TNF-α、IL-6、IL-1β抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及干預(yù)方法除正常組外，其他組均采用D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］腹腔連續(xù)注射8 周制備AD 樣模型大鼠［8］。造模結(jié)束后進(jìn)行干預(yù)，方法如下：（1）EA 組：根據(jù)余曙光《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［9］取動(dòng)物針灸常用“百會(huì)”和兩側(cè)“腎俞”穴。0.25 mm × 15 mm 毫針向前15°角平刺“百會(huì)”3 ～4 mm，“腎俞”向脊柱方向斜刺3 ～4 mm，一組導(dǎo)線分別接“百會(huì)”和“腎俞”，左右“腎俞”穴隔日交替使用。予連續(xù)波，頻率50 Hz，電流1 mA，以針刺局部顫動(dòng)即可。（2）rTMS 組：采用YRD CCY-1型電磁刺激儀，固定大鼠頭部，將“8”字線圈垂直緊貼大鼠顱部左側(cè)前額葉，刺激頻率為5 Hz，最大輸出強(qiáng)度為90%，重復(fù)脈沖磁刺激10 串，每串10 次。（3）EA＋rTMS 組：電針治療之后進(jìn)行重復(fù)經(jīng)顱磁刺激，方法及刺激參數(shù)同EA 組和rTMS 組，以上干預(yù)1 次/日，共2 周。

1.2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)水池直徑120 cm，高60 cm。平臺(tái)置于第4 象限，池中裝水直至水面高出平臺(tái)2 cm，水溫保持在（23.0±0.5）℃。兌入奶粉攪拌，使整個(gè)背景與大鼠頭部涂有黃色苦味酸的毛發(fā)形成反差，在水池每個(gè)象限邊緣中點(diǎn)貼上標(biāo)簽作為入水點(diǎn)。定位航行試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前將大鼠放入水池自由游泳2 min 以適應(yīng)水池環(huán)境。將大鼠面向池壁從4 個(gè)入水點(diǎn)依次放入水中，記錄其在120 s 內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間（即逃避潛伏期）和游泳路徑。若大鼠在120 s 內(nèi)未能找到平臺(tái)則牽引至平臺(tái)停留10 s，記錄其逃避潛伏期為120 s，連續(xù)實(shí)驗(yàn)5 d。空間探索實(shí)驗(yàn)：第6 天移去平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)的對(duì)側(cè)象限入水點(diǎn)投放水中，自由游泳120 s，記錄各組大鼠在原平臺(tái)象限探索時(shí)間。

1.2.3 透射電鏡觀察大鼠海馬區(qū)突觸后致密帶厚度行為學(xué)測試結(jié)束后每組選4 只大鼠，稱重按量，腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，置冰上快速剝離出新鮮海馬組織，迅速轉(zhuǎn)入現(xiàn)配的電鏡固定液中，4 ℃固定2～3 h。3 d 后0.01 MPBS 漂洗組織，1%鋨酸固定1 h，漂洗后在不同濃度乙醇里進(jìn)行梯度脫水，隨后丙酮液中浸透，環(huán)氧樹脂包埋劑中35 ℃過夜，最后聚合、切片和染色，透射電鏡觀察及拍片，用Image-pro plus 6.0 軟件來計(jì)算突觸后致密帶厚度。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠海馬區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量每組取4 只大鼠將其麻醉，心臟灌注固定后斷頭取腦，置固定液中24 h。隨后滴蠟包埋、切片。組織常規(guī)脫臘清洗，檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后PBS 清洗3 次，H2O2室溫孵育以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS 沖洗，滴加山羊血清封閉，再滴加Iba-1 一抗（1∶100），濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS 清洗3 次；滴山羊抗兔IgG H&L（Cy3?）預(yù)吸附二抗，濕盒避光孵育1 h，PBS 沖洗3次；然后滴辣根酶室溫孵育，加入現(xiàn)配DAB 顯色液，染至棕黃色，PBS 沖洗后滴加蘇木素染色60 s，隨后1%HCL 分化10 s，脫水，風(fēng)干，封片。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot 法檢測大鼠海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平大鼠快速斷頭，解剖分離出海馬，配置凝膠加入樣品蛋白，進(jìn)行組織樣品蛋白提取；現(xiàn)配RIPA 裂解液，PBS 漂洗，加裂解液進(jìn)行高速離心勻漿；取上清液測定蛋白濃度，根據(jù)PAGE 凝膠電泳分離出目標(biāo)條帶，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，在TBST 中封閉滴加一抗，4 ℃孵育過夜清洗再滴二抗，室溫避光孵育2 h，經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。收集圖像，使用AlPhaEaseFC軟件對(duì)樣品條帶的吸光度值進(jìn)行數(shù)字化分析，以β-actin 為參照蛋白，目的蛋白與β-actin 的比值則為其相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraPhPad Prism.8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較用方差分析，組間多重比較方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)第1 天各組間逃避潛伏期無差異；第2 天模型組與正常組與EA+rTMS 組比，逃避潛伏期延長（P＜0.01）；此后3 d 各干預(yù)組逃避潛伏期隨著訓(xùn)練的延長比模型組明顯縮短（P＜0.01），表明各組大鼠在持續(xù)學(xué)習(xí)訓(xùn)練中已逐漸通過學(xué)習(xí)記憶找到平臺(tái)。空間探索實(shí)驗(yàn)中模型組比其余組在目標(biāo)象限探索時(shí)間明顯縮短（P＜0.01）；EA + rTMS 組比EA 組和rTMS 組在目標(biāo)象限探索時(shí)間又顯著延長（P＜0.01）。說明EA 和rTMS 刺激干預(yù)都能改善大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，EA 聯(lián)合rTMS 刺激治療比單獨(dú)使用EA 或rTMS 刺激療效更顯著。見圖1、2。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期比較Fig.1 Comparison of escape latency of rats ineachgroup

圖2 各組大鼠在目標(biāo)象限探索時(shí)間比較Fig.2 Comparison of exploration time in the target quadrant of rats in each group

2.2 各組大鼠海馬區(qū)突觸后致密帶厚度比較與正常組比較，模型組大鼠海馬區(qū)突觸后致密帶稀薄（P＜0.01），前后膜界限不清；與模型組比較，各干預(yù)組大鼠突觸后致密帶厚度增大（P＜0.01）；與EA+rTMS 組比，EA 組和rTMS 組大鼠突觸后致密帶厚度更顯著變薄（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)突觸后致密帶厚度比較Fig.3 Comparison of the thickness of the postsynaptic dense zone in the hippocampus of rats in each group

2.3 各組大鼠海馬區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較與正常組比較，模型組小膠質(zhì)細(xì)胞胞核增大，偽足增長，數(shù)量增多（P＜0.01）；與模型組比較，各干預(yù)組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯下降（P＜0.01）；與EA + rTMS 組比較，EA 組和rTMS 組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較Fig.4 Comparison of the number of the activatedmicrogliacells in hippocampus of rats in each group

2.4 各組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)比較與正常組比較，模型組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)增強(qiáng)，與模型組比較，各干預(yù)組蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與EA+rTMS 組比較，EA 組和rTMS 組海馬區(qū)各蛋白表達(dá)均上升（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠海馬區(qū)炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)量比較Fig.5 Comparison of the expression levels of inflammation-related proteins in hippocampus of rats in each group

3 討論

AD 的病理發(fā)展過程復(fù)雜多變，至今認(rèn)為腦組織中大量神經(jīng)元損傷和突觸丟失是AD 的典型病理特征［10］。人類大腦主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞兩類細(xì)胞組成。神經(jīng)元是神經(jīng)回路形成的基本單位，它由軸突、樹突以及突觸構(gòu)成。神經(jīng)突觸是神經(jīng)元之間信息傳遞形成回路的核心部件，也是產(chǎn)生認(rèn)知記憶的基本［11］。突觸由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜構(gòu)成，PSD 是突觸后膜內(nèi)側(cè)胞質(zhì)面一層致密物質(zhì)，它參與突觸后膜信息的重組與編輯，影響突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能有重要作用［12］。膠質(zhì)細(xì)胞中小膠質(zhì)細(xì)胞（microgia，MG）介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和突觸丟失的關(guān)鍵［13］。MG 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的防御細(xì)胞，但在AD 進(jìn)程中持續(xù)激活的MG 對(duì)突觸過度吞噬清除，造成突觸喪失及認(rèn)知功能下降［14］。有研究結(jié)果顯示電針和rTMS 可改變動(dòng)物MG 的激活，提高突觸重組和傳遞效能，保護(hù)神經(jīng)元［15-16］。本研究也顯示EA 和rTMS 有保護(hù)神經(jīng)元的作用，但EA 與rTMS 聯(lián)合比單一的治療方法更加有效地抑制MG 的激活，增大PSD 厚度，使神經(jīng)突觸之間緊密連接，極大地提高了AD 樣模型大鼠逃避潛伏期和在目標(biāo)象限探索時(shí)間，是控制大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損害的可行手段。

同時(shí)持續(xù)激活的MG 釋放大量的促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β［17-18］等，促進(jìn)APP 形成和Aβ沉積，誘導(dǎo)Aβ斑塊周圍的神經(jīng)元丟失及凋亡，加重炎癥反應(yīng)［19］。本研究顯示EA 結(jié)合rTMS 比單獨(dú)的EA 組和rTMS 組顯著地減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放。

綜上所述，EA 結(jié)合rTMS 或許是通過抑制AD樣模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低對(duì)突觸的損害從而提升大鼠空間學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力。但是本研究中對(duì)大鼠突觸的改變是激活的MG 引起的還是炎癥因子引起的，還是兩者皆有，有待進(jìn)一步研究。