去泛素化酶組成型光形態發生因子9信號復合體5上調甲硫氨酸腺苷轉移酶2A表達促進肝癌細胞增殖

謝培一 陳磊峰 盧虹成 杜棟年 李家娟 邵江華

南昌大學第二附屬醫院肝膽外科，江西省分子醫學重點實驗室（南昌330006）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年的新發病例中，有51%的病例發生在我國［1］。近年來，雖然肝切除技術及肝癌綜合治療水平明顯提高，但是HCC預后仍然不佳［2-3］。其中，肝癌細胞的快速增殖是影響HCC 患者預后的重要原因之一［4］。因此，探討肝癌細胞增殖相關機制已成為目前的熱點。

組成型光形態發生因子9 信號復合體5（constitutive photomorphogenic-9 signalosome subunit 5；CSN5）最初被鑒定為激活蛋白-1（activator protein 1；AP-1）復合體成員c-Jun 的協同激活因子［5］。研究［6-7］表明CSN5 屬于去泛素化酶，主要參與細胞DNA 修復、凋亡和增殖。研究［8-9］表明CSN5 表達上調可以抑制抑癌基因的活性，還可以上調多種促癌基因表達進而促進腫瘤細胞增殖。雖然有文獻報道CSN5 在肝癌表達增加并且與增殖有關，但是CSN5 促進HCC 增殖的分子機制仍不完全清楚，有待進一步研究［10］。

另外，研究［11-12］已經證明甲硫氨酸腺苷轉移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）在肝癌組織中高表達并與肝癌的增殖有關。然而，CSN5 與MAT2A 的表達與肝癌增殖之間的關系仍未見報道。本研究探討CSN5是否可以調控MAT2A的表達并進而影響肝癌細胞的增殖能力，為臨床治療肝細胞癌提供了分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑肝癌細胞和正常肝細胞從中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫購買。DMEM 培養液以及胎牛血清購自美國Gibco 公司；LipofectAMINE?3000 轉染試劑和TRIzol-Reagent 購自美國Invitrogen 公司；兔抗人CSN5 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，兔抗人MAT2A 多克隆抗體和鼠抗人tubulin 多克隆抗體購自美國Proteintech公司，免疫組織化學檢測試劑盒和DAB 顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；含有特異性針對CSN5 基因的shRNA-1、shRNA-2 的干擾質粒（分別命名為shCSN5-1 和shCSN5-2）以及含有陰性shRNA 的對照質粒（命名為shNC）均由上海吉凱基因化學技術有限公司構建。

1.2 肝癌標本收集在南昌大學第二附屬醫院獲得經過肝癌患者切下的肝癌組織和癌旁組織，從2017年6月至2019年7月收治的肝癌患者手術切除標本63 例，其中男46 例，女17 例，患者年齡范圍為31 ～75 歲，平均年齡（62±5.1）歲。及時將新鮮的組織妥善存放在保存液中，于-80℃的液氮中保存，部分可放于福爾馬林液體中保存，1 周之內進行石蠟組織包埋，用于免疫組織化學等研究。所有患者樣本的獲取經醫院倫理學委員會授權。

1.3 細胞培養及轉染人HCC 細胞HCCLM3，MHCC97H，Huh7，HepG2 以及人永生化肝細胞株（HL-7721 等）可用包含10%胎牛血清（FBS，Hy-Clone，USA）的DMEM（Gibco）在37℃恒溫無菌培養箱培養，并進行傳代或轉染處理。將CSN5 shRNA-1（靶點序列為5′-AGCGAGGTAAAGTTGCGTCT-3′）、shRNA-2（靶點序列為5′-AATGCAAAACAGGTTGGCCG-3′）的shCSN5-1/2 干擾質粒和陰性對照shRNA 干擾片段轉染至肝癌HCCLM3 細胞。轉染實驗步驟參照LipofectAMINE?3000 轉染試劑說明進行。

1.4 免疫組織化學法HCC組織及癌旁組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，脫蠟。然后，用微波加熱抗原修復液（EDTA，pH8.0）25 min 使組織的抗原充分修復，并用山羊血清封閉40 min。進而用PBS 溶液稀釋抗CSN5 單克隆抗體（sc135954，1∶500，Santa Cruz）并在4℃下孵育過夜。其次，HRP 結合二級抗體（Boster）室溫下孵育2 h。采用DAB 檢測試劑盒（Maxim）進行免疫染色2 min，并用TBST 溶液洗滌組織切片3 次。最后，由3 名對病理學家對染色后陽性區域的比例進行半定量評分［13］。

1.5 蛋白質印跡法提取總蛋白后，蛋白質濃度由BCA蛋白質分析試劑盒（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）進行分析。細胞提取液在裂解緩沖液中煮沸20 min，離心后，用十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。分離的蛋白條帶通過電印跡法轉移到PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上，然后與一抗在4℃下孵育過夜。用TBST 洗滌3 次，室溫下與第二抗體孵育2 h。主要抗體包括抗CSN5 單克隆抗體（sc135954，1∶1 000，Santa Cruz）、抗MAT2A 多克隆抗體（55309-1-AP，1∶1 000，Proteintech）和Tubulin 單克隆抗體（11224-1-AP，1∶2 000，Proteintech）。用TBST 洗滌3 次，室溫下與第二抗體孵育2 h。使用Quantity One 軟件（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測量每個蛋白條帶的強度［14］。

1.6 實時定量PCR（qRT-PCR）采用TRIzol 法抽提各組細胞的總RNA，用紫外分光光度計測定總RNA 純度并定量。采用實時定量PCR 技術檢測細胞中RNA 水平。cDNA 用PrimeScript RT 試劑盒（Invitrogen，USA）進行反向轉錄獲得，然后使用SYBR Premix Ex-Taq（TaKaRa Bio，Shiga，Japan）按照制造商的說明進行qPCR。本實驗所用到的主要引物序列如下CSN5，Forward：5′-AGAGTTTGTTCCCGTGGTGC-3′，Reverse：5′-CGAGGAAGCGGAGAAGTTGT-3′；MAT2A，Forward：5′-CATGAACGGACAGCTCAACG-3′，Reverse：5′-AGCATAAGCAGCTGAACGGT-3′。每個樣品均設3 個復孔，設定閾值，測定平均循環閾值（cycle threshold，Ct）。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達水平［15］。

1.7 統計學方法三個獨立實驗的所有結果均用均數±標準差表示。兩組樣本均數的比較采用配對t檢驗或獨立樣本t檢驗；多組樣本間均數的比較采用方差分析，對有意義的因素再采用LSD-t檢驗進行組間多重比較。所有數據用GraphPad Prism 5 軟件分析，P＜0.05 被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織中CSN5 的表達水平明顯增高通過免疫組織化學法檢測63 例（含31 例新鮮標本）人體肝癌標本及癌旁組織中CSN5 的表達情況（圖1A）發現CAN5 在肝癌組織中表達明顯升高。通過實時熒光定量PCR 和蛋白質印跡法（圖1B-D）檢測了31 例新鮮標本，結果表明肝癌組織中CSN5的mRNA 和蛋白表達水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。

圖1 CSN5 在肝癌組織中表達明顯升高Fig.1 CSN5 is aberrantly upregulated in HCC tissues

2.2 肝癌細胞株中CSN5 的表達明顯高于正常肝細胞實時熒光定量PCR（圖2A）和蛋白質印跡法（圖2B）檢測不同肝癌細胞及正常肝細胞中CSN5 的表達情況，結果表明：4 種肝癌細胞株中CSN5 mRNA 以及蛋白表達水平均明顯均高于正常肝細胞（P＜0.05）。

圖2 CSN5 在HCC 細胞中的表達明顯上調Fig.2 CSN5 expression in HCC cell lines is significantly increased

2.3 CSN5 表達與肝癌細胞的增殖密切相關實時熒光定量PCR 結果和蛋白質印跡法結果（圖3A和3B）顯示，在HCCLM3 細胞中干擾CSN5 的表達，CSN5 表達明顯下調（P＜0.001）。EdU 細胞增殖實驗結果表明，在肝癌HCCLM3 細胞中，干擾CSN5后EdU 陽性細胞所占百分比較shNC 對照組明顯降低（P＜0.01，圖3C）。

圖3 干擾CSN5 的表達抑制HCC 細胞增殖Fig.3 CSN5 suppression inhibited HCC cell growth

2.4 CSN5 通過調節MAT2A 的表達進而影響肝癌細胞的增殖熒光定量PCR 結果（圖4A 和4B）表明，在肝癌HCCLM3 細胞中干擾CSN5 的表達，CSN5 mRNA 和蛋白水平下調，MAT2A 蛋白水平也明顯下降（P＜0.01）。回復實驗顯示在MAT2A過表達的HCCLM3 細胞中，MAT2A 蛋白的表達明顯升高，但是同時干擾CSN5 表達后，可逆轉MAT2A 表達升高（圖4C）。同時，EdU 細胞增殖試驗表明，干擾CSN5 導致的肝癌細胞增殖能力的降低可以被MAT2A 過表達所回復（圖4D）。

圖4 CSN5 通過MAT2A 調節肝癌細胞增殖Fig.4 CSN5 regulates HCC cells proliferation through MAT2A

3 討論

肝癌細胞增殖在原發性肝癌發生和發展中發揮重要作用，因此研究肝癌細胞增殖的分子生物學機制或許對肝癌的防治有重要意義。研究已表明CSN5 是一個癌基因并且在多種惡性腫瘤的發生發展扮演重要角色［13，16-17］。本研究通過檢測HCC 病人的臨床標本發現CSN5 在肝癌中的mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁組織。進一步研究發現，CSN5 在多株肝癌細胞中表達明顯增加，下調肝癌細胞株CSN5 的表達可以明顯抑制肝癌細胞的增殖能力。以上研究提示CSN5 在肝癌的發展過程中扮演促癌作用，或許可以作為一個潛在的腫瘤治療靶點，但是其具體調控肝癌細胞增殖的機制尚未明確，有待進一步研究。

MAT2A 主要在肝臟疾病中廣泛研究，并且研究［18-20］表明MAT2A 可以作為快速生長和去分化的標志。研究［21-22］表明特異性蛋白1（specificity protein 1；SP1）和p65 表達增高均可以促進MAT2A 過表達。然而，肝癌細胞中CSN5 與MAT2A 的表達關系仍未見報道。在本研究中，發現CSN5 可以調控MAT2A 的表達進而影響肝癌細胞的增殖。結果顯示，通過干擾CSN5 在肝癌細胞中的表達，發現CSN5 下調可以抑制MAT2A 的表達進而抑制肝癌細胞的增殖能力。最后，通過回復實驗，證實MAT2A 是CSN5 促進肝癌細胞增殖的關鍵分子。

綜上所述，CSN5 可以通過調控MAT2A 表達促進肝癌細胞的增殖。本研究為進一步研究肝癌的增殖提供了新的理論基礎，并為臨床上肝癌的基因治療提供了新的思路。然而本實驗還具有一定的局限性，未探究CSN5 在肝癌細胞中調控MAT2A的具體機制，未進一步擴大對臨床肝癌標本的檢測并對肝癌病人的臨床預后進行分析。針對本實驗的不足，我們將進一步探究CSN5 通過何種方式調控MAT2A 的表達，進一步增加肝癌標本的檢測，并對相關病人的預后信息進行歸納分析。