CAⅨ聯(lián)合CD8+TIL對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

楊楊 梁羅嬌 周琛斐 陳曉靜 王薇

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510120）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌的主要轉(zhuǎn)移途徑和影響宮頸癌治療及預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。有研究顯示，臨床上約15%～20%的宮頸癌患者在行根治性手術(shù)前已經(jīng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后需加用放化療，對(duì)比單純根治性放化療，手術(shù)后追加放化療的遠(yuǎn)期預(yù)后無明顯改善，相反雙重治療的遠(yuǎn)期并發(fā)癥增加［2］。2018年，國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)盟組織（International Federation of Gynecology and Obstertrics，F(xiàn)IGO）婦科腫瘤委員會(huì)發(fā)布宮頸癌診治最新指南，術(shù)前證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，治療首選根治性放化療［3］，這對(duì)術(shù)前準(zhǔn)確診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提出更高的要求。目前臨床最常用的方法是MRI、CT 掃描，但敏感性及特異性偏低。PET-CT檢查、前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)是近年新興的評(píng)估方法，但PET-CT 檢測(cè)僅提高病灶＞10 mm的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性［4］。前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)，由于示蹤方法和病理檢測(cè)技術(shù)的局限，假陰性率可達(dá)16.6%［5］。因此，為了規(guī)避宮頸癌患者雙重治療，尋找新的檢測(cè)方法提高術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢出率具有重要臨床意義。

缺氧腫瘤微環(huán)境是實(shí)體瘤的常見特征，在腫瘤轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為中起重要作用［6-7］。課題組前期研究已證實(shí)，宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與缺氧密切相關(guān)［8］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonicanhydraseⅨ，CAⅨ）屬于一種跨膜蛋白，是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)基因，可作為腫瘤細(xì)胞缺氧的標(biāo)記物［9］。CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumorinfiltratinglymphocytes，TIL）是腫瘤微環(huán)境中最核心的免疫效應(yīng)T 細(xì)胞，可抑制腫瘤的惡性進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，已在乳腺癌、胰腺癌等多種實(shí)體腫瘤中被證實(shí)［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，多種實(shí)體腫瘤中，缺氧微環(huán)境的改善，可增加CD8+TIL 的浸潤(rùn)，是抗腫瘤治療的有效靶點(diǎn)［11］。然而，宮頸癌中，兩者相關(guān)的研究尚未見報(bào)道。近期文獻(xiàn)報(bào)道，宮頸癌組織中上皮細(xì)胞激酶（epithelial cell kinase，EphA2）和轉(zhuǎn)錄因子Twist 蛋白表達(dá)量的聯(lián)合檢測(cè)可提高宮頸癌的預(yù)后判斷［12］。本研究分析CAⅨ和CD8+TIL在宮頸癌組織中的表達(dá)分布情況，探討二者的相關(guān)性及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值，希望為宮頸癌的診治提供更多的臨床策略。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2011年至2014年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一院婦產(chǎn)科收治的宮頸癌（按照2014年FIGO分期IB-IIA期）患者75例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理活檢確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌；（2）術(shù)前經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的婦科主任醫(yī)師診斷臨床分期IB-IIA 期的宮頸癌患者；（3）既往未接受化療、放療等抗腫瘤治療；（4）所有患者或家屬均告知并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑CAⅨ、CD8 兔抗人多克隆抗體、二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色組織樣本經(jīng)病理科確診入組，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，3%過氧化氫封閉，加CD8 一抗的組織切片先給予2%牛血清蛋白封閉10 min，分別加入一抗（CAⅨ：1∶500，CD8：1∶200），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶1 000）37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水封片。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 CAⅨ的判定在高倍視野下（×200）觀察，綜合陽性腫瘤細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定：百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：＞75%為4 分，35% ～75%為3 分，10%～34%為2 分，1%～9%為1 分，＜1%為0 分；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為1 分；染色力弱（淺黃色）為2 分；中度染色（黃棕色）為3 分；染色力強(qiáng)（褐色）為4 分。染色指數(shù)（SI）為陽性腫瘤細(xì)胞百分比得分與染色強(qiáng)度得分的乘積之和。用SI 評(píng)估CAⅨ的表達(dá)，SI ＜8 確定為低表達(dá)，SI ≥8 為高表達(dá)。

1.4.2 CD8+TIL 的判定根據(jù)CD8+TIL 的染色分布，將CD8+TIL 分為癌巢內(nèi)［Intraepithelial CD8+Tlymphocytes，CD8+TIL（i）］和間質(zhì)內(nèi)［Stromal CD8+Tlymphocytes，CD8+TIL（s）］。在高倍鏡（× 400）視野下按癌巢及間質(zhì)分別隨機(jī)選取3 個(gè)視野。對(duì)視區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)三次，取平均值，再取三個(gè)視野的平均值，根據(jù)CD8+TIL 中位數(shù)將患者分為低浸潤(rùn)組（＜中位數(shù)）和高浸潤(rùn)組（≥中位數(shù)）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0和Graphpad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示。采用Spearman 相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。組間結(jié)果的差異比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以n（%）的形式表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。采用logistic 二元回歸分析建立宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷的logistic 回歸模型，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評(píng)估各組對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)效能。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAⅨ和CD8+TIL 的表達(dá)及相關(guān)性免疫組化染色結(jié)果顯示：CAⅨ表達(dá)位于癌巢腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒狀。CD8+TIL 位于腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，在癌巢和間質(zhì)中均有表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀（見圖1A）。觀察到，癌巢CAⅨ表達(dá)升高往往伴隨著癌巢CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少，間質(zhì)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多（圖1A）。利用Spearman 相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：CAⅨ的表達(dá)與癌巢CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.559 7，P＜0.001），與間質(zhì)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量呈顯著正相關(guān)（r= 0.462，P＜0.001，圖1B）。

圖1 CAⅨ、CD8+TIL 在宮頸癌中的免疫組化染色情況及其相關(guān)性Fig.1 Immunohistochemicalstainingandrelativity of CAⅨand CD8+TIL in CC

2.2 CAⅨ和CD8+TIL與臨床病理特征的關(guān)系利用χ2或Fisher 精確檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示：在宮頸癌組織中，CAⅨ高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.024），與患者的年齡、FIGO 分期、分化程度、脈管浸潤(rùn)均無關(guān)（P＞0.05），癌巢、間質(zhì)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)高低與患者的年齡、FIGO 分期、分化程度、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05，見表1）。

表1 CAⅨ或CD8+TIL 的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression level of CAⅨor CD8+TIL in CC patientsand clinicopathological features 例

2.3 CAⅨ聯(lián)合CD8+TIL 對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值CAⅨ和CD8+TIL 在對(duì)應(yīng)淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織（28 例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，47 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）中的免疫得分，利用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示：在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中，CAIX（P= 0.001）、癌巢CD8+TIL（P＜0.001）的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，間質(zhì)CD8+TIL 的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084，圖2）。

圖2 CAⅨ、CD8+TIL 在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of CAⅨand CD8+TIL in CC tissues with or without LNM

隨后，通過logistic 二元回歸分析構(gòu)建宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移聯(lián)合診斷模型。繪制CAⅨ單指標(biāo)及聯(lián)合不同分布CD8+TIL 的ROC 曲線（圖3），并根據(jù)約登指數(shù)（Youden index）最大原則得到各參數(shù)的最佳診斷截?cái)嘀担╟ut off 值）。結(jié)果顯示：CAⅨ聯(lián)合間質(zhì)CD8+TIL 具有最高的靈敏度（78.6%）、陰性預(yù)測(cè)值（83.3%），而CAⅨ聯(lián)合癌巢CD8+TIL 具有最高的特異度（100%）、陽性預(yù)測(cè)值（100%）、準(zhǔn)確度（85.3%）以及最大曲線下面積（AUC=0.837）。綜合來看，CAⅨ聯(lián)合癌巢CD8+TIL 的檢測(cè)在預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，具有最高的診斷效能（表2）。

表2 各參數(shù)對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷效能比較Tab.2 Comparison of the diagnostic efficiency of various parameters for LNM of CC

圖3 CAⅨ、CAⅨ聯(lián)合CD8+TIL 預(yù)測(cè)宮頸癌LNM 的ROC曲線Fig.3 ROC curve for prediction of LNM of CC with CAⅨand CAⅨcombined CD8+TIL

3 討論

隨著FIGO、美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）對(duì)于宮頸癌診治指南的不斷更新，術(shù)前區(qū)域淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移直接影響宮頸癌治療方案的選擇［13］。近年來，隨著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）對(duì)于調(diào)控腫瘤惡性進(jìn)展及轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，缺氧和TIL 是TME 的重要特征和主要免疫應(yīng)答細(xì)胞［14］。本研究通過免疫組化法檢測(cè)宮頸癌組織病理切片中CAⅨ和CD8+TIL 的表達(dá)分布，探討二者在腫瘤微環(huán)境中的相關(guān)性，及對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷的預(yù)測(cè)效能，為臨床提供更精準(zhǔn)的個(gè)體化治療模式，改善患者的預(yù)后。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧（hypoxia）是TME中調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素。有研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實(shí)體腫瘤中，癌細(xì)胞CAⅨ的表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)［9］。本課題組前期研究證明，腫瘤微環(huán)境中，缺氧促進(jìn)宮頸癌惡性進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［8］，與本研究的結(jié)果一致，在宮頸癌組織中，CAⅨ的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性（P=0.024），伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中，CAⅨ的表達(dá)明顯升高（P=0.001）。GUO 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，CD8+TIL 存在不同的亞型，因分布和功能的不同，影響患者的預(yù)后。本研究分析了癌巢及間質(zhì)CD8+TIL的數(shù)量，結(jié)果顯示：宮頸癌組織中，癌巢CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著減少（P＜0.001），提示癌巢CD8+TIL 可能與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這與GORTER［16］等人的研究結(jié)果相符合。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CAⅨ高表達(dá)的組織，癌巢CD8+TIL 數(shù)量減少，間質(zhì)CD8+TIL數(shù)量增多。既往多項(xiàng)研究表明，缺氧腫瘤微環(huán)境發(fā)生代謝變化，如癌細(xì)胞釋放乳酸，腺苷等引起的酸中毒，嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的功能和增殖［17］。在肺腺癌中，LI［18］團(tuán)隊(duì)證實(shí)，缺氧腫瘤微環(huán)境抑制CD8+TIL的募集及浸潤(rùn)，結(jié)合本課題的發(fā)現(xiàn)，推測(cè)腫瘤微環(huán)境中，缺氧可能參與CD8+TIL的調(diào)控。

綜上，推斷CAⅨ和癌巢CD8+TIL 在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮相互制約作用。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于缺氧聯(lián)同CD8+TIL 的研究鮮少，但有研究證實(shí)，腫瘤組織中，相較于單一因素的檢測(cè)，PDL1 聯(lián)合CD8+TIL 的檢測(cè)成為患者預(yù)后評(píng)估更有利因素［19］。因此本研究構(gòu)建宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移聯(lián)合診斷模型，結(jié)果顯示，CAⅨ聯(lián)合癌巢CD8+TIL 在預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，具有最高的診斷效能，其中特異度、陽性預(yù)測(cè)值為100%，理論上可避免淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的誤診，在一定意義上增強(qiáng)了臨床醫(yī)生診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的信心，同時(shí)為臨床個(gè)體化治療方案的選擇提供了理論依據(jù)。

本研究作為回顧性研究，仍需通過大規(guī)模的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)本研究缺乏患者術(shù)后隨訪資料的統(tǒng)計(jì)，不能評(píng)估兩者的檢測(cè)對(duì)患者預(yù)后價(jià)值的預(yù)測(cè)效能。后期研究將加強(qiáng)患者的術(shù)后隨訪，完善生存數(shù)據(jù)的分析。

綜上所述，宮頸癌組織中，缺氧和癌巢CD8+TIL的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者相互制約，聯(lián)合檢測(cè)可作為術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因素。鑒于在宮頸癌組織中，缺氧可能參與CD8+TIL 的調(diào)控，影響腫瘤免疫微環(huán)境，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，研究重點(diǎn)可靶向二者作用的具體機(jī)制，為宮頸癌的治療開發(fā)新靶點(diǎn)，這也將是本課題今后的研究方向。