銀、銅離子對臨床常見致病細菌的抑菌性能研究

黃曉燕 丘早瑜 陳麗丹 李林海

世界衛生組織(WHO)頒布的《院內感染防治實用手冊》數據顯示60% 的細菌感染與使用醫療器械有關［1］,包括手術器材及植入材料。銀、銅具有抗菌作用早有報道,在醫用耗材中加入具有強烈抗菌功能的銀、銅金屬納米單質或離子均可達抗菌目的［2,3］,但其具體作用及機制尚在探索階段,無統一標準。本實驗通過研究Ag+、Cu2+對臨床常見致病細菌［大腸埃希菌(escherichia coli,CRE)、肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant klebsiella pneumoniae,CRKP)、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PAE)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus,MASA)及糞腸球菌(enterococcus faecails,EFA)］的抗菌性能,為臨床使用和研發新型抗菌材料提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1Ag+、Cu2+溶液的配制 利用滅菌去離子水配制濃度均為 0.1 M 的硝酸銀(AgNO3)和氯化銅(CuCl2·2H2O)水溶液,用0.22 m 的濾菌器過濾后裝在無菌容器備用,其中硝酸銀的配制及保存需要避光操作。

1.1.2菌株

1.1.2.1臨床菌株 隨機選取本院檢驗科微生物室分離的來源于傷口分泌物及組織的多重耐藥菌株飾物CRE、CRKP、PAE、MARA、EFA,所有菌株均采用法國梅里埃VITEK MS 全自動快速微生物質譜檢測儀進行鑒定,菌株保存于-80℃冰箱。

1.1.2.2標準 菌株 CRE(ATCC25922)、CRKP(ATCC700603)、PAE(ATCC27853)、MARA(ATCC25923)、EFA(ATCC29212)干粉均購自廣東臨床檢驗中心,溶解后轉種血平板備用。

1.1.2.3菌株貯存 將上述臨床菌株及標準菌株接種至血平板,35℃ CO2溫箱培養24 h 備用。

1.1.3陽離子調節肉湯(CAMHB) 的配制 稱取CAMHB 肉湯干粉22.0 g,加熱溶解于1000 ml 去離子水中,121℃高壓滅菌20 min 備用。

1.1.4無菌去離子水 取去離子水121℃高壓滅菌20 min 后備用。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備［4］取上述所有菌株的24 h 新鮮培養物接種至CAMHB 肉湯,35℃ CO2溫箱恒溫增菌6 h 后,用比濁儀配制成0.5 麥氏單位的菌懸液(相當于108cfu/ml),再用無菌去離子水梯度稀釋為100 倍,使之成為106cfu/ml 的菌懸液,備用。

1.2.2梯度濃度Ag+、Cu2+溶液的配制 將0.1 M 的Ag+、Cu2+離子溶液梯度稀釋為10-2～10-8M 的溶液,備用。

1.2.3Ag+、Cu2+離子抑菌實驗 實驗孔：分別取100 μl 配制好的10-2～10-8M 濃度Ag+、Cu2+離子溶液置于96 孔板中,加入106cfu/ml 細菌懸液100 μl,振蕩混勻。以上步驟重復3 次作平行試驗,蓋好蓋板,置35℃CO2溫箱共同培養 6 h。對照孔：取100 μl 滅菌去離子水置于96 孔板中,加入106cfu/ml 細菌懸液100 μl,振蕩混勻。以上步驟重復3 次作平行試驗,蓋好蓋板,置35℃ CO2溫箱共同培養6 h。取出培養液,吹打混勻,每孔用無菌去離子水稀釋100 倍,各取100 μl 接種至血平板,置35℃ CO2溫箱培養24 h,記錄平板菌落數取平均值,計算殺菌率。殺菌率(%)=(Ncontrol-Nsample)/Ncontrol×100%。Ncontrol 為空白組菌落數,Nsample為實驗組菌落數。

1.3觀察指標及判定標準 比較兩種離子對CRE、CRKP、PAE、MARA、EFA 及ATCC25922、ATCC700603、ATCC27853、ATCC25923、EFAATCC29212 的MBC。參照GB/T 2591 標準,殺菌率≥99%可以報告有強抗菌作用；殺菌率≥90%可以報告有抗菌作用。

1.4統計學方法 應用軟件GraphPad Prism 7.04 對數據進行處理和運算。

2 結果

①當Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-5M 時,對CRE 有殺菌作用；當Ag+濃度≥10-6M、Cu2+濃度≥10-4M 時,對ATCC25922 有殺菌作用。兩種離子對CRE 的MBC 均較ATCC25922 小。見圖A1,圖B1。

A1 Ag+ concentration

B1 Cu2+ concentration

②當Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時,對CRKP 有殺菌作用；當Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時,對ATCC700603 有殺菌作用。兩種離子對CRKP 的MBC 與ATCC700603 一致。見圖A2,圖B2。

A2 Ag+ concentration

B2 Cu2+ concentration

③當Ag+濃 度≥10-6M、Cu2+濃 度≥10-5M 時,對PAE 有殺菌作用；當Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時,對ATCC27853 有殺菌作用。兩種離子對PAE 的MBC 均比ATCC27853 高。見圖A3,圖B3。

A3 Ag+ concentration

B3 Cu2+ concentration

④當Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時,對有MASA 殺菌作用；當Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時,對ATCC25923 有殺菌作用。兩種離子對MASA 的MBC 與ATCC25923 一致。見圖A4,圖B4。

A4 Ag+ concentration

B4 Cu2+ concentration

⑤當Ag+濃 度≥10-5M、Cu2+濃 度≥10-5M 時,對EFA 有殺菌作用；當Ag+濃度≥10-6M、Cu2+濃度≥10-5M 時,對ATCC29212 有殺菌作用。對于Ag+,EFA 的MBC 比ATCC25923 高,但對于Cu2+,兩種細菌的MBC 一致。見圖A5,圖B5。

A5 Agg++ concentration

B5 Cu2+ concentration

3 討論

通過實驗,可以觀察到臨床菌株與標準菌株的MBC 相同或者變化不大,均只需要較低的Ag+、Cu2+濃度,就可以達到卓越的抑菌效果,推測其殺菌能力與細菌的耐藥性相關性不大。在細菌感染耐藥率高居不下的現狀下,Ag+、Cu2+的研究前景是可觀的,有望為臨床新材料的開發帶來新的飛躍。同時,Ag+、Cu2+對革蘭陰性桿菌的抑菌作用比革蘭陽性球菌強,對PAE及EFA 的殺菌性能較差,分析可能與細菌的結構及耐藥機制有關。在結構上,由于革蘭陽性球菌的細胞壁比陰性桿菌厚,金屬離子不能輕易滲透到細胞內,故MBC 相對較大；其次,PAE 的耐藥機制中的細胞膜通透性改變(如孔蛋白減少、生物被膜的形成),可能減少離子的攝取和吸收,且具有主動外排系統能把Ag+、Cu2+泵出菌體外而導致MBC 變大；而EFA 的MBC 增大原因主要為細胞壁滲透障礙導致Ag+、Cu2+難以進入菌體,及質粒介導的鈍化酶的產生有對Ag+、Cu2+的破壞和滅活的作用等,故抑菌效果相對弱。盡管如此,Ag+、Cu2+仍然對所有實驗菌株具有高度敏感性。目前關于金屬離子的應用大多是傷口外用敷料及皮膚表面的涂抹、噴灑消毒［5-7］,且其抑菌作用的研究大多數采用標準菌株,很少用臨床菌株,本文選用來源于傷口分泌物及組織的臨床菌株與標準菌株對比來研究Ag+、Cu2+的抑菌性能,更貼近臨床實際。

綜上所述,Ag+、Cu2+對臨床五種常見致病菌及標準菌株均有明顯抑菌作用,可作為除抗生素外的新型有效抗菌材料廣泛應用于臨床。