尿毒清顆粒微生物限度檢查方法適用性研究及質量評價

卜紅宇，高瑞霞，滕赟，張茜，周剛

內蒙古自治區藥品檢驗研究院，內蒙古 呼和浩特 010020

尿毒清顆粒主要是由黃芪、大黃、白術、桑白皮、茯苓、丹參、川芎等組成，主要用于慢性腎功能衰竭氮質血癥以及尿毒癥，執行標準為國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS3-229（Z-033）-2000（Z）。查閱文獻，關于尿毒清顆粒的研究主要集中在治療慢性腎功能衰竭及早期糖尿病腎病的臨床研究方面［1-4］，未見關于尿毒清顆粒微生物限度檢查的報道。為了控制藥物質量，本實驗按照《中國藥典》2015 年版四部通則［5］對尿毒清顆粒微生物限度檢查法進行方法適用性研究，在此基礎上評價了84 批尿毒清顆粒的微生物污染情況，為全面評價尿毒清顆粒質量提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

樣品與培養基：84 批尿毒清顆粒（來源：國家藥品抽檢，規格：5 g/袋，處方一致），蛋白胨水、胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖液體、沙氏葡萄糖瓊脂、胰酪大豆胨液體、麥康凱瓊脂、麥康凱液體；以上培養基均為美國BD 公司生產。

菌種：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］（中國食品藥品檢定研究院提供）。

儀器：AC2-4SI 型生物安全柜（Esco Micro Pte有限公司），PL602-S 型電子天平（梅特勒-托利多集團），MIR-554 型培養箱（日本三洋公司），高壓蒸汽滅菌柜（Getinge Sterilization 有限公司），超低溫保存箱（海爾集團），Easy MIX 型均質器（生物梅里埃法國股份有限公司），移液器（Eppendorf生命科學公司）。

1.2 菌液制備

取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌及白色念珠菌的新鮮培養物，制成5 000～10 000 CFU/mL 的菌懸液。取培養5～7 d的黑曲霉培養物，將孢子洗脫，制成5 000～10 000 CFU/mL 的孢子懸液。

1.3 供試液制備

取供試品10 g，置于無菌均質袋中，加100 mL的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，用均質器拍打1 min，搖勻，作為1∶10 的供試液。

1.4 需氧菌總數、霉菌及酵母菌適用性試驗

采用平皿法驗證供試品有無抑菌性：取1∶10供試液9.9 mL 和0.1 mL 試驗菌混勻，取1 mL 注皿，平行制備2 個平皿。回收率測定：回收率=（試驗組平均菌落數-供試品組平均菌落數）÷菌液組平均菌落數×100%；回收率應該在50%～ 200%范圍內。試驗組為9.9 mL 供試液加入0.1 mL 試驗菌；菌液組為9.9 mL 不含中和劑及滅活劑的稀釋液加入0.1 mL 試驗菌；供試品組為9.9 mL 供試液加入0.1 mL 稀釋液。

1.5 控制菌檢查方法適用性試驗

采用常規法驗證供試品有無抑菌性：大腸埃希菌試驗組為取1∶10 供試液10 mL 及不大于100 CFU 的大腸埃希菌加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中；依控制菌檢查法，在規定的溫度和最短的時間下培養，應能檢出所加試驗菌的反應特征。

2 結果

2.1 微生物檢查法適用性試驗結果

從表1 中可以看出，供試品銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及黑曲霉的回收率均在50%～200%，說明可采用1∶10 平皿法檢測需氧菌總數、霉菌和酵母菌。從表2 中可以看出，試驗組檢出大腸埃希菌的反應特征，表明本品在該條件下對大腸埃希菌的抑制作用可以忽略不計，可采用常規法進行本品的大腸埃希菌檢查。

表1 需氧菌總數、霉菌及酵母菌適用性試驗

表2 大腸埃希菌試驗結果

2.2 84 批樣品微生物限度檢查結果

本實驗采用“2.1”中建立的微生物檢查法對84 批尿毒清的微生物指標進行檢測，結果見表3。對84 批供試品需氧菌計數結果統計分析，尿毒清顆粒需氧菌總數X<10 有55 批，約占65.5%；10 ≤X<101有17 批，約占20.2%；101≤X<102有11 批，約占13.1%；X>102有1 批，約占1.2%；需氧菌總數均未超過103CFU/g，合格率為100%。對尿毒清顆粒霉菌及酵母菌統計分析發現，霉菌及酵母菌總數X<10 有71 批，約占84.5%；10 ≤X<101有7 批，約占8.3%；101≤X<102有6 批，約占7.1%；霉菌及酵母菌總數均未超過102CFU/g，合格率為100%。84 批尿毒清顆粒均未檢出大腸埃希菌。

表3 84批尿毒清顆粒微生物限度檢查結果

3 討論

尿毒清顆粒的微生物限度按照《中國藥典》2015 年版四部通則1107 要求，需氧菌總數不得過103CFU/g；霉菌和酵母菌數不得過102CFU/g；不得檢出大腸埃希菌（1 g）。本研究中，84 批供試品均符合《中國藥典》要求，整體質量較穩定，但供試品的需氧菌、霉菌及酵母菌總數仍存在較大差異，這說明該產品衛生質量存在一定問題。提示生產企業加強微生物污染的監測控制，規范生產。

中藥材易受微生物的污染，細菌、放線菌和真菌是污染中藥材常見的微生物，致病真菌的污染最嚴重［6-7］。微生物污染是藥品質量評估的重要指標［8］，微生物在自然界分布廣泛，微生物污染的來源和途徑很多［9-11］，包括藥材原料的種植、晾曬、收集、儲藏等，也包括制劑生產商的各個生產環節，如生產環境、設備、原料、人員等各方面。建議生產商推進微生物過程控制理念的實施，建立過程管理控制程序［12］，在整個生產過程中監測控制微生物的污染，使微生物負載降至最低。另外，生產商也應該監測產品在存放過程中微生物的影響因素及變化規律，以確保產品在有效期內不會受到微生物污染。

本實驗建立了尿毒清顆粒的微生物檢查方法，采用1∶10 平皿法檢查需氧菌總數和霉菌及酵母菌總數；采用常規法檢查大腸埃希菌。檢測了84 批尿毒清顆粒的微生物限度指標，合格率100%，尿毒清顆粒的衛生質量相對穩定。