柴胡加龍骨牡蠣湯對H2O2損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用的研究

許 訓(xùn)，劉 薇，劉 昆，袁康瑞，葉曉梅，劉小柳，吳都督，陳 稚* （廣東醫(yī)科大學(xué).動物中心；.藥學(xué)院，廣東東莞 5808；.廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 58000）

氧化應(yīng)激和抗氧化防御的失衡與阿爾茲海默癥(AD)等多種疾病密切相關(guān)[1-3]。近年來，中藥用于AD的治療受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[4-9]。柴胡加龍骨牡蠣湯（CLM）源于仲師之《傷寒論》，其方藥由小柴胡湯去甘草加桂枝、茯苓、龍骨、牡蠣、鉛丹、大黃而成，具有化飲理肝、陰陽調(diào)和之功效[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，CLM 具有抗氧化、衰老、抗炎等作用[11]，在治療抑郁、癲癇、癡呆等疾病方面也有較好的療效[12-13]，如肖慧瓊等[14]發(fā)現(xiàn)CLM 能降低顳葉癲癇患者血清中的MDA 含量，增加SOD 活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。因此，本研究探討CLM 對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與制作

柴胡、龍骨、生姜、人參、去皮桂枝、茯苓、洗半夏、黃芩、鉛丹、大黃、牡蠣、擘大棗（廣東時珍制藥有限公司），按原方比例即柴胡62 g，龍骨、生姜、人參、去皮桂枝、茯苓各23 g，洗半夏20 g，黃芩16 g，鉛丹23 g，大黃31 g，熬牡蠣23 g，擘大棗6 枚稱取定量的藥材，再量取5 倍量的75%乙醇，將藥材浸泡120 min之后，加熱回流，收集濾液；再重復(fù)一次上述過程，收集濾液。將兩次的濾液收集于同一燒杯中，過濾、濃縮，制成濃度為10 g/mL CLM母液。小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞株(上海細(xì)胞庫)；二甲基亞砜(索萊寶)；DMEM 高糖培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶（含EDTA），胎牛血清(GIBCO，美國)；H2O2溶液(AR)(Sigma)；細(xì)胞裂解液(RIPA）（碧云天)；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒(南京建成生物工程公司)，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒；BCA法蛋白定量試劑盒(賽默菲)；一抗(兔抗鼠IgG) (Santa Cruz 公司)；二抗(熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG)(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 PC12 細(xì)胞的培養(yǎng) 先在超凈臺配制含有20%胎牛血清、100 kU/L 青霉素和100 g/mL 鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化傳代在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后的PC12 細(xì)胞，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CLM對PC12細(xì)胞增殖的影響 采用CCK8法檢測CLM 對PC12 細(xì)胞生存率的影響，用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，將其進(jìn)行離心，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，按5 000 個細(xì)胞/孔加入96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h。將CLM 溶于DMEM 中，并通過梯度稀釋的方法，配制成0.1、1.0、5.0 g/mL 的低、中、高劑量組，每組濃度分別設(shè)置3 個平行孔，放置上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。空白對照組用DMEM做相同處理。培養(yǎng)24、48及72 h后，每孔加入10 μL CCK8 試劑，搖勻，在37 ℃條件下避光孵育2 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測OD 值。取3孔的均數(shù)，細(xì)胞活力(%)=（試驗(yàn)孔均值/對照孔均值）×100%。

1.2.3 CCK8 檢 測CLM 對PC12 細(xì)胞的保護(hù)將PC12 細(xì)胞以5 000 個/孔的密度將PC12 細(xì)胞種于96孔板中，每孔100 μL。置于孵箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為5 組：空白對照組、H2O2損傷模型組（200 μmol/L）、CLM 低劑量組：CLM（0.1 g/mL）+H2O2（200 μmol/L）、CLM 中劑量組：CLM（1.0 g/mL）+H2O2（200 μmol/L）及CLM高劑量組:CLM（5.0 g/mL）+H2O2（200 μmol/L）。反應(yīng)24 h后，加入CCK8試劑10 μL，37 ℃反應(yīng)1 h后，采用酶標(biāo)儀在450 nm下測OD值。細(xì)胞活力(%)=（試驗(yàn)孔均值/對照孔均值）×100%。

1.2.4 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA 與SOD 含量測定 PC12 細(xì)胞在H2O2的損傷過程中，細(xì)胞內(nèi)的LDH 釋放到胞外，由于在活細(xì)胞中無法釋放，因此通過檢測細(xì)胞外LDH 的量，因此可以間接反映細(xì)胞的損傷程度。收集1.2.3 處理后的培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照LDH、MDA 與SOD 測定試劑盒說明書進(jìn)行處理，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA 與SOD 各酶的OD 值并計算相應(yīng)活性。

1.2.5 CLM 對PC12 細(xì)胞的核因子E2 相關(guān)因子2(Nrf-2)表達(dá)水平的影響 將PC12細(xì)胞接種于6孔板，接種密度為3×106個/mL，共設(shè)置5組，依次為對照組、損傷模型組、CLM 低、中、高劑量組。孵箱孵育24 h后棄置培養(yǎng)基，PBS 洗2 次后用吸水紙吸干，放置于冰上。每孔加80 μL 蛋白裂解液，并置于冰上裂解，時間為30 min。將細(xì)胞碎片與裂解液用細(xì)胞刮刮至一側(cè)，并轉(zhuǎn)至1.5 mL EP 管（1.2×104r/min、4 ℃）離心10 min。取其中2.5 μL 上清液用BCA 法測定其蛋白濃度，剩下液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg 蛋白，使用10%SDS 聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，并用脫脂奶粉進(jìn)行封閉，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜。PBST 洗膜，加入熒光二抗，室溫反應(yīng)2 h，用紅外熒光成像系統(tǒng)顯色。用Image J圖像軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 20.0 軟件包分析數(shù)據(jù)，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)每組均重復(fù)8次，計量資料以表示，多組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CLM對PC12細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，CLM 低、中、高劑量組對PC12 細(xì)胞的增殖率均明顯增加(P＜0.01)，且以CLM高劑量組最為顯著(P＜0.01)，CLM 低、中、高劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 CLM對PC12細(xì)胞增殖的影響 (,n=8)

表1 CLM對PC12細(xì)胞增殖的影響 (,n=8)

與對照組比較：aP＜0.01；與CLM 低劑量組比較：bP＜0.01；與CLM中劑量組比較：cP＜0.01

2.2 CLM對PC12細(xì)胞存活率的影響

與對照組比較，H2O2損傷組PC12 細(xì)胞的存活率明顯降低(P＜0.01)；與H2O2模型損傷組比較，CLM低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均明顯提高(P＜0.01)，且以CLM高劑量組最為顯著(P＜0.01)，見圖1。

圖1 CLM對H2O2誘導(dǎo)損傷后的PC12細(xì)胞存活率的影響

2.3 PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA和SOD含量測定

與對照組比較，H2O2損傷模型組細(xì)胞中的LDH和MDA 的含量增大，SOD 酶活性明顯下降（P＜0.01）。經(jīng)CLM 干預(yù)后，與H2O2損傷模型組相比，不同濃度的CLM組均能有效降低細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量和MDA 含量(P＜0.01)，以CLM 高劑量組更為顯著（P＜0.01），見表2。

表2 CLM 對H2O2 誘導(dǎo)PC12 損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA和SOD含量的影響 (,n=8)

表2 CLM 對H2O2 誘導(dǎo)PC12 損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA和SOD含量的影響 (,n=8)

與對照組比較：aP＜0.01；與H2O2損傷模型組比較：bP＜0.01；與CLM低劑量組比較：cP＜0.01；與CLM中劑量組比較：dP＜0.01

2.4 CLM對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖2 所示，與對照組相比，H2O2損傷模型組的PC12 細(xì)胞胞質(zhì)不飽滿、邊緣不清晰、透光性差且生長緩慢，而CLM 給藥組隨著濃度增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，且濃度越高，細(xì)胞狀態(tài)越好。

圖2 CLM對H2O2損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

2.5 CLM對PC12細(xì)胞的Nrf-2核蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組相比，H2O2損傷模型組中的Nrf-2 蛋白水平明顯下降，用不同劑量CLM 處理后，Nrf-2 蛋白水平有所提高，且以CLM 高劑量組更明顯(P＜0.01)。見表3。

表3 CLM對PC12細(xì)胞的Nrf-2核轉(zhuǎn)運(yùn)的灰度值的影響 (,n=8)

表3 CLM對PC12細(xì)胞的Nrf-2核轉(zhuǎn)運(yùn)的灰度值的影響 (,n=8)

與對照組比較：aP＜0.01；與H2O2損傷模型組比較：bP＜0.01；與CLM低劑量組比較：cP＜0.01

3 討論

根據(jù)現(xiàn)代臨床研究進(jìn)展，CLM 對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、婦科病等均有較好的治療作用。CLM 治療各種類型的抑郁癥如腫瘤后抑郁、帕金森伴發(fā)抑郁等療效顯著，對室性早搏和心絞痛等心血管疾病也有較好的治療效果[10]。CLM 的抗氧化作用也是如今研究的熱點(diǎn)。本研究在觀察CLM 對PC12 細(xì)胞增殖的影響中，結(jié)果顯示，與對照組相比，CLM 低、中、高劑量組對PC12 細(xì)胞的增殖率均明顯增加(P＜0.01)，且以CLM 高劑量組最為顯著(P＜0.01)，表明不同濃度的CLM 對PC12 細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用，且隨著濃度的增加，CLM 對PC12 細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用增強(qiáng)。在觀察細(xì)胞存活率中，經(jīng)CLM 干預(yù)后，與H2O2損傷模型組相比，不同濃度的CLM 組均能有效降低細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH 含量和MDA 含量(P＜0.01)，以CLM 高劑量組更為顯著（P＜0.01），也表明CLM 能有效抑制H2O2損傷導(dǎo)致的細(xì)胞存活率下降，提高PC12細(xì)胞的存活率，對由于過氧化損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

SOD 作為系統(tǒng)中至關(guān)重要的抗氧化酶，對于氧化平衡系統(tǒng)有著舉足輕重的作用。因此，SOD 可以作為細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的指標(biāo)[16]。MDA 能反映脂質(zhì)過氧化的程度及清除氧自由基的能力[17]。經(jīng)H2O2損傷的PC12 細(xì)胞，出現(xiàn)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、胞內(nèi)MDA 累積、自由基水平升高，作為自由基清除劑的SOD消耗增加。本研究結(jié)果顯示不同濃度的CLM 處理PC12細(xì)胞后，MDA含量下降、SOD活性增加，表明CLM 可以在一定程度上對抗H2O2導(dǎo)致的過氧化損傷。

Nrf-2 是細(xì)胞中抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體內(nèi)起到重要的抗氧化作用。它可對抗神經(jīng)炎癥，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，從而起到緩解神經(jīng)退行性疾病的作用。有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Nrf-2在細(xì)胞質(zhì)中受到Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)的嚴(yán)格調(diào)控，在無應(yīng)激的情況下，Keap1 有效地介導(dǎo)Nrf-2 的多泛素化，導(dǎo)致其被泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)(UPS)降解。Nrf-2 是細(xì)胞抗炎和抗氧化防御基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Nrf-2 信號的選擇性激活，可有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中炎性因子的釋放[18]。在H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，發(fā)現(xiàn)CLM 各濃度組核內(nèi)Nrf-2 蛋白表達(dá)明顯升高，表明CLM 能有效促進(jìn)Nrf-2 的核轉(zhuǎn)位，CLM 可能通過調(diào)節(jié)Nrf-2 蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述，CLM 對由H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與CLM 降低LDH、MDA含量，增強(qiáng)SOD 酶活性以及調(diào)節(jié)核內(nèi)Nrf-2 蛋白水平的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的研究可為CLM 作為抗氧化劑抑制PC12 細(xì)胞的過氧化損傷，進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。