高效液相色譜串聯質譜法同時測定人血清8種葉酸循環代謝物

李慧敏，刁嘉茵，鄭康帝，張 召,3，林炳耀，林東子*（.東莞市濱海灣中心醫院，廣東東莞 53900；.廣東省人體微生態工程技術研究中心，廣東廣州 5000；3.廣東南芯醫療科技有限公司，廣東廣州 5000；.佛山市第四人民醫院，廣東佛山 58000）

葉酸及其衍生物5-甲酰四氫葉酸（5-FoTHF，亞葉酸）、5-甲基四氫葉酸（5-MeTHF）、5,10-亞甲基四氫葉酸（5,10-CH2-THF）和四氫葉酸（THF）等主要影響DNA 合成和DNA 甲基化兩個過程[1-2]，可以治療貧血及神經系統疾病，也可以用作早孕期間預防胎兒畸形[3-9]。在尿嘧啶脫氧核苷酸（dUMP）到胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP）的轉化過程中，dUMP 因葉酸缺乏導致積累，錯誤摻入DNA，進而在DNA 復制和修復過程中誘發基因突變、DNA 單雙鏈斷裂、染色體斷裂等各種遺傳異常[10-11]。葉酸攝入不足將影響同型半胱氨酸（Hcy）代謝途徑，導致DNA 和RNA 甲基化異常及改變基因表達，從而引發各類相關疾病的發生[12-13]。隨著生活水平的不斷提高、三胎政策的放開、出生率的降低等一系列因素，葉酸檢測已成為母嬰階段的重要檢測指標。目前，臨床葉酸檢測多以化學發光法為主，常單獨測試葉酸及同型半胱氨酸，主要因為此方法具有自動化程度高、重現性好、靈敏度高等優點[14-15]，但化學發光法無法對葉酸代謝中的多種衍生物同時進行檢測[15-16]。為協助臨床醫生明確患者葉酸缺乏的原因，探究葉酸檢測指標豐富、檢測結果穩定、靈敏度高、葉酸上下游產物共檢等要求已成為該領域的難點。本文基于液相串聯質譜平臺對葉酸代謝過程中的多種關鍵化合物進行定量檢測，以期為臨床上葉酸缺乏相關癥狀的診治提供參考。

1 資料和方法

1.1 儀器試劑

島津LC-20AC 型液相色譜儀；島津CL8050 型質譜儀；乙腈、甲酸銨和甲酸（St.Lous,美國）；去離子水（Millipore、MA、USA）；葉酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF 標準品均購買自Sigma-Aldrich 上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度均大于98%。

1.2 方法

1.2.1 校準品、質控品及提取試劑配制（1）PBS 緩沖液：稱取磷酸二氫鉀0.24 g，磷酸氫二鈉1.44 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，加入去離子水約800 mL 充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH 至7.4，定容至1 L即得。（2）牛血清白蛋白溶液：稱取適量牛血清白蛋白，按50 g/L 加入PBS緩沖液溶解，混勻即得。（3）三聯抗氧化劑：稱取抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇（DTT）適量，加入甲醇，分別配制成1 g/L 甲醇溶液，然后按抗壞血酸:檸檬酸:DTT:水=1:1:1:7 配制成質量濃度為100 mg/L的三聯抗氧化劑。（4）儲備液配制：稱取適量各標準品葉酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF、5,10-CH2-THF、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和Hcy，分別加入三聯抗氧化劑，配制成1 g/L的各儲備液。（5）混合內標溶液配制：取葉酸內標和Hcy儲備液，用三聯抗氧化劑稀釋成葉酸內標為1 g/L，Hcy為20 g/L 的混合內標溶液。（6）校準品的配置：先將各儲備液配制成梯度混合標準品溶液，然后按混標:牛血清白蛋白溶液=1:99 配制成如下質量濃度校準品，見表1。（7）質控品的配置：先將各儲備液配制成2個混合標準品溶液，然后按混標:牛血清白蛋白溶液=1:99配制成如下濃度質控品，見表2。（8）提取液配置：提取液1為配制含100 mg/L抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇的甲醇溶液；復溶液2為配制含100 mg/L 抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇的10%乙腈溶液。（9）前處理方法：取100～200 μL 樣本（血清、校準品或質控品）至EP 管中，加入5 μL 混合內標溶液和500 μL 提取液1 后渦旋振蕩1 min，混勻。離心后轉移400～500 μL 上清于96 孔進樣板中。氮氣吹干，加入100 μL 復溶液2，覆上鋁箔封膜，檢測備用。將96 孔進樣板放入自動進樣器中，準備上機。

表1 8種人體葉酸循環代謝物標準品的配置信息（C1-C6為標曲的6個質量濃度，μg/L）

表2 8種人體葉酸循環代謝物質控品的配置信息（μg/L）

1.2.2 測定方法（1）色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液。流速450 μL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL，洗脫梯度見表3。（2）質譜條件：在電噴霧離子正離子檢測模式下，采用MRM (Multi Reaction Monitoring)掃描分析，離子源參數霧化氣流量為3 L/ min，干燥氣流量為2 L/min，加熱氣流量為15 L/min。DL 管(Dashlaunch)溫度為100～400 ℃，接口溫度為100～400 ℃，加熱塊溫度為100～400 ℃，碰撞誘導裂解氣壓為100～300 kPa，前體與產物離子通道見表4。

表3 8種人體葉酸循環代謝物流動相洗脫信息

表4 8種人體葉酸循環代謝物液質檢測前體與離子碎片信息

1.2.3 方法學探究 低、中、高濃度的質控樣本分別在提取前和提取后加入內標，按樣品處理方法進行樣本提取與上機檢測，分析方法的精密度。同一樣本平均分成6 份，前3 份每份按樣本提取方法提取后分別加入低、中、高濃度的內標作為組1 質控樣本上機檢測；后3 份每份分別加入低、中、高濃度的內標按提取方法提取后作為組2質控樣本上機檢測回收率。

2 結果

2.1 標曲線性范圍與檢測限

8種人體葉酸循環代謝物的總離子流圖譜見圖1。各葉酸循環代謝的線性相關系數為0.994～0.999，表明線性關系良好，最低檢出限為0.128 μg/L。采用內標進行定量，葉酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF、5,10-CH2-THF 均共用葉酸內標。SAM、SAH 和Hcy 共用Hcy 內標。以校準品待測物峰面積與對應內標峰面積的比值作為縱坐標（y），以各校準品的質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線。標準曲線擬合后，相關系數r＞0.99。此外質控品測試準確度符合85%～115%，各個指標的檢測限及定量限如表5所示。

表5 8種人體葉酸循環代謝物的回歸方程、相關系數、準確度及檢測線

圖1 8種人體葉酸循環代謝物總離子流圖譜

2.2 精密度與準確度

由表6 可知，8 種人體葉酸循環代謝物精密度RSD 值為3.9%～12.3%，回收率RSD 值為85.4%～113.1%，精密度良好，回收率較高，說明方法的準確度良好。

表6 8種人體葉酸循環代謝物的精密度及回收率

2.3 樣本檢測結果

分別取兒童、孕婦志愿者樣本各50份，按1.2.1方法處理后，測定葉酸循環代謝產物含量，結果范圍如表7所示。

表7 樣本檢測結果

3 討論

葉酸是促進機體健康的重要物質，是人體細胞生長和繁殖的必須物質，在造血系統中對紅細胞形態和代謝有著重要的作用[17]。葉酸可以協助胎兒發育，預防胎兒神經管畸形的發生，準媽媽在備孕期間服用葉酸可大幅度降低胎兒神經管畸形率[18]。同時，葉酸與同型半胱氨酸代謝關系密切，對預防心血管疾病的發生具有重要的意義[13]。隨著生活水平的不斷提高、三胎政策的放開，葉酸保健品的市場占有份額不斷增大，但由于缺乏科學的指導，葉酸使用現狀混亂。因此，通過檢測人體內葉酸及其循環代謝物的真實狀態，針對性地調整、明確葉酸潛在需求，更符合個性化治療要求。

飲食攝入的葉酸主要以多聚谷氨酸鹽的形式，葉酸代謝首先在腸黏膜上水解，二氫葉酸轉移酶先是將葉酸還原為二氫葉酸，再生成四氫葉酸。四氫葉酸產生甲?；?、甲基、亞甲基等葉酸形式底物，亞甲基四氫葉酸經甲基四氫葉酸還原酶催化轉變為5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸即是葉酸在血液的主要形式。當前，臨床在進行葉酸檢測分析時，不能明確全部葉酸循環代謝產物的含量，大大限制了醫生對患者葉酸缺乏的判斷。為此，臨床急需一種可同時、快速、準確檢測人體葉酸循環代謝物的方法。檢測葉酸的主要方法為高效液相色譜法、時間分辨法、免疫化學發光法。免疫化學發光法穩定性較好但特異性差，高效液相色譜法靈敏度高但穩定性差，但這幾種方法均難以同時檢測多種葉酸循環代謝產物指標[16]。

本文基于液相串聯質譜全面對葉酸代謝過程中的多種關鍵化合物進行定量檢測，方法高效、靈敏，檢測下限較低，準確度高，能對整個葉酸代謝水平進行全面評估[19]，可滿足人體葉酸循環代謝物常規測定的要求，但其普適性有待進一步的研究確定。