西洋參破壁飲片中8種人參皂苷類成分雙標多測法的建立

于現花 劉軍玲 金傳山 張亞中 栗進才

摘 要 目的：建立同時測定西洋參破壁飲片中8種人參皂苷類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）測定西洋參破壁飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd的含量。色譜柱為Agilent5 TC-C18柱;流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脫）;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;檢測波長為203 nm;進樣量為10 μL。以人參皂苷Re和人參皂苷Rb2為參照物，采用雙標線性校正法預測其余6種成分的保留時間以對其進行定性，并比較該方法與相對保留時間法的差異;以人參皂苷Re為參照物，采用相對校正因子法對上述成分進行定量，并與外標法定量結果進行比較。結果：西洋參破壁飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd的含量分別為10.59～12.78、2.160～2.768、27.492～38.880、3.154～4.018、3.368～4.080、0.343～0.755、0.961～1.415、5.857～6.923 mg/g。采用雙標線性校正法預測成分保留時間的準確性更高，且預測保留時間的絕對偏差均低于相對保留時間法;采用相對校正因子法和外標法的定量結果差異不大，相對誤差（RE）均小于3%。結論：所建立的雙標多測法可同時對西洋參破壁飲片中8種人參皂苷類成分進行準確定性和定量。

關鍵詞 西洋參破壁飲片;人參皂苷;雙標多測法;雙標線性校正法;相對校正因子法;高效液相色譜

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 8 kinds of ginsenosides in Panax quinquefolium broken pieces. METHODS： HPLC-DAD method was used to determine the contents of ginsenoside Rg1， Re， Rb1， Rc， Ro， Rb2， Rb3， Rd in P. quinquefolium broken pieces. The determination was performed on Agilent5 TC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃. The detection wavelength was set at 203 nm， and sample size was 10 μL. Ginsenoside Re and ginsenoside Rb2 were used as control， liner calibration with two-reference substances correction was used to predict the retention time of other 6 components， and was compared with the relative retention time method. Using ginsenoside Re as control， above components were quantified by the relative correction factor method， and the results were compared with the external standard method. RESULTS： The contents of ginsenoside Rg1， Re， Rb1， Rc， Ro， Rb2， Rb3， Rd were 10.59-12.78， 2.160-2.768， 27.492-38.880， 3.154-4.018， 3.368-4.080， 0.343-0.755， 0.961-1.415， 5.857-6.923 mg/g. The accuracy of two-reference substances linear correction method to predict the retention time of components was higher， and the absolute deviation of the predicted retention time was lower than that of the relative retention time method. There was no significant difference between the relative correction factor method and the external standard method， and relative error was <3%. CONCLUSIONS： Established two-reference substances for determination of multiple components can be used for qualitative and quantitative analysis of 8 kinds of ginsensides in P. quinquefolium broken pieces simultaneously and accurately.

KEYWORDS? ?Panax quinquefolium broken pieces; Ginsenoside; Two-reference substances for determination of multiple components; Two-reference substances linear correction method; Relative correction factor method; HPLC

西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefolium L.的干燥根，原生長于北美洲的東部，我國于17世紀開始引進種植，已有300多年的應用歷史[1-3]。傳統中醫理論認為，西洋參性涼而補，具有補氣養陰、清熱生津的功效，主要用于陰虛燥咳、勞嗽咳血等[1]。現代藥理學研究表明，西洋參具有抗腫瘤、免疫調節、改善心血管系統疾病等作用[4-5]。相關研究發現，西洋參中含有皂苷類、氨基酸類、糖類、黃酮類和無機元素類等活性成分，其中皂苷類是其最主要的活性成分[6]。

西洋參較為名貴，常將其制成破壁飲片，以最大限度地利用其藥效成分，且對節約藥材資源具有重要意義[7]。目前，多以2020年版《中國藥典》（一部）中規定的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量作為西洋參破壁飲片的質量評價指標[1]，但僅測定這3種成分，并不能全面反映西洋參的內在質量。

對于中藥的多成分含量測定，相關研究者提出采用替代對照品法或一測多評法[8-14]，但這些方法均是以一個成分作為內參，對多個目標成分以相對校正因子法進行定量、以相對保留時間法進行定性，雖節約了對照品，但定性和定量的誤差稍大[14]。后續孫磊等[15]提出了“雙標多測法”，即以2個對照品采用雙標線性校正法對其他色譜峰進行定性，并結合相對校正因子法對其他成分進行定量;且在相同分析條件下，雙標線性校正法提高了色譜峰定性的準確度和色譜柱的適用性，實現了目標成分在不同品牌、型號的色譜柱和色譜儀間保留時間模型的遷移均存在線性關系。因此，在實際應用中，可利用這種線性關系提高保留時間的重現性[15-16]?；诖?，本研究建立了測定西洋參破壁飲片中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 含量的雙標多測法，以期為該飲片多指標成分綜合質量控制和評價提供思路。

1 材料

1.1 主要儀器

UItiMate 3000型高效液相色譜（HPLC）儀及所配備的二極管陣列檢測器（DAD）檢測器購自美國Dionex公司; LC-20AT型HPLC儀購自日本Shimadzu公司;1260 型HPLC儀及所配備的VWD檢測器購自美國Agilent公司;XP26型百萬分之一電子分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司;185型超純水儀購自美國Millipore 公司。

1.2 主要藥品與試劑

人參皂苷Rg1（批號110703-201128，純度≥93.4%）、人參皂苷Re（批號110754-201626，純度≥92.7%）、人參皂苷Rb1（批號110704-201122，純度≥92.9%）、人參皂苷Rc（批號110021-14-0，純度≥98%）、人參皂苷Ro（批號111903-201102，純度≥98%）、人參皂苷Rb2（批號111715-200501，純度≥98%）、人參皂苷Rb3（批號111686-200501，純度≥98%）、人參皂苷Rd（批號111818-201001，純度≥94.4%）均為對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇為色譜純，磷酸、正丁醇為分析純，水為超純水。

10批西洋參破壁飲片樣品（編號S1～S10）均購自安徽宏信藥業發展有限公司，經安徽省食品藥品檢驗研究院張亞中主任中藥師鑒定為五加科植物西洋參P.quinquefolium L. 的干燥根。

1.3 其他材料

本研究共用到14根色譜柱（編號col 1～col 14） ，其中col1為ZORBAX Eclipse Plus C18，col2為Agilent5 TC-C18，col 3為DIKMA Diamonsil C18，col4為DIKMA Inspire C18，col 5為Phenomenex Kinetex C18 100A，col 6為JADE-PAK ODS-AQ，col 7為Innoval C18，col 8為TechMate C18 ST，col 9為TechMate CR（1 ∶ 5）-ST，col 10為Venusil ASB C18，col 11為Waters XBridge C18，col 12為ZORBAX Eclipse XDB C18，col 13為Shim-pack VP-ODS，col 14為Phenomenex Luna C18，所有色譜柱的規格均相同（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

選用UItiMate 3000型高效液相色譜儀;定性研究的色譜柱選擇col 1～col 13;定量研究色譜柱選擇col 2;流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，81%B;15～20 min，81%B→79%B;20～35 min，79%B→75%B;35～55 min，75%B→68%B;55～70 min，68%B→57%B;70～73 min，57%B→47%B;73～75 min，47%B→81%B）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為203 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd對照品適量，精密稱定，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解，配制成質量濃度分別為 0.25、1.378、3.86、0.41、0.388、0.076、0.166、0.65 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 參考文獻[1]方法，取西洋參破壁飲片粉末（過三號篩，下同）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，稱定質量;水浴加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質量，以水飽的正丁醇補足減失的質量，搖勻，濾過;精密量取續濾液25 mL，置于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣加50%甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液（編號S2）和陰性對照溶液（即50%甲醇溶液）適量，按“2.1”項下色譜條件（色譜柱為col 2）進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，各待測成分峰分離度均大于1.5，見圖1。

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液2、1、0.5、0.35、0.25 mL， 分別置于2 mL量瓶中，以甲醇定容， 搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液;按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以目標成分質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。

2.3.3 精密度考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 峰面積的RSD分別為1.35%、1.57%、0.91%、1.08%、0.91%、1.57%、1.21%、0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性考察 取同一批西洋參破壁飲片粉末（編號S2）6份，每份約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件下進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程中計算8種成分的含量。結果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 的平均含量分別為2.467、12.338、36.054、3.301、2.692、0.306、0.818、6.420 mg/g，RSD分別為0.40%、0.35%、0.14%、0.14%、1.80%、2.92%、1.39%、0.16%（n=6），表明方法重復性較好。

2.3.5 穩定性考察 取同一份供試品溶液（編號S2），分別于室溫放置0、2、8、10、12、24 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 峰面積的RSD分別為0.36%、0.33%、0.14%、0.10%、1.74%、2.86%、2.39%、0.14%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率考察 取已知成分含量的西洋參破壁飲片粉末（編號S2）約0.5 g，精密稱量，共6份，精密加入人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd的對照品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表2。

2.4 基于雙標線性校正法的定性研究

2.4.1 不同色譜柱上保留時間的線性關系考察 基于“2.1”項下色譜條件，采用13根不同的色譜柱進行試驗，并以同一成分在13根色譜柱上的實測保留時間的平均值作為預測保留時間（SRT）[15-16]。結果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd的SRT分別為31.316、31.972、60.348、61.997、63.194、63.590、64.117、66.825 min。基于雙標線性校正法的平衡分配機理，組分的保留時間在不同色譜儀及色譜柱上的保留時間具有線性關系[16]，以8種人參皂苷類成分的SRT為橫坐標（x）、實測保留時間為縱坐標（y），采用OriginPro 9.0軟件進行擬合，即得8種人參皂苷類成分在不同色譜柱上保留時間的線性方程及相關系數，見表3。

2.4.2 雙標化合物的確定 將色譜圖（cdf格式文件）導入 DRS Origin 軟件中，點擊“增加參照”，設定雙標成分，再于該軟件的樣品測試頁面點擊“關聯對照品”，然后于方法開發頁面點擊“方法優化”，即得10種優化方案（見表4，其中CRS為化學標準物質）。當10種優化方案的色譜峰預測準確率和色譜柱符合率均達到100%，則說明試驗所選的13根色譜柱適用性較好[17]。按照雙標化合物選擇保留時間回歸偏差相對較小和所選化合物保留時間段盡可能分布在色譜峰的兩端的原則[15，18]，本研究選定人參皂苷Re和人參皂苷Rb2作為雙標化合物來驗證色譜柱col 14。以人參皂苷Re、Rb2的SRT值31.972、63.590 min為橫坐標（x），以兩者的實際保留時間為縱坐標（y），進而得到兩點線性方程：y=0.960 1x+3.423 1;再將其余6個成分的SRT值代入方程，得到人參皂苷Rg1、Rb1、Rc、Ro 、Rb3、Rd的預測保留時間分別為33.489 6、61.363 2、62.946 4、64.095 7、64.981 8、67.581 8 min，其與實際保留時間的相對偏差分別為 0.57%、0.42%、0.30%、0.27%、0.02%、0.16%。這符合定性條件下，預測保留時間與實測保留時間的誤差≤0.5 min 的要求[18]，表明該方法在col 14色譜柱上的預測效果良好。

2.4.3 雙標線性校正法與相對保留時間法的比較 基于“2.4.2”項下結果，采用雙標線性校正法并以人參皂苷Re、Rb2作為雙標化合物，采用相對保留時間法并以人參皂苷Rb2為參照物，分別對保留時間進行預測，然后得出其余6種人參皂苷類成分預測保留時間的絕對偏差。結果，雙標線性校正法預測的6種人參皂苷類成分保留時間的絕對偏差均低于相對保留時間法，且前者絕對偏差值的波動范圍相較后者更小，表明采用雙標線性校正法來預測人參皂苷類成分的保留時間的準確性更高，見表5。

2.5 基于相對校正因子法的定量研究

2.5.1 相對校正因子的計算 采用多點校正法[19-20]，即以多點計算所得的相對校正因子（fsi）平均值用于定量。取“2.3.2”項下混合對照品溶液，共5份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以人參皂苷Re為參照物，分別計算人參皂苷Rg1、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd的相對校正因子fsi（fsi=fs/fi=As×ci/cs×Ai，其中As為參照物的峰面積，cs為參照物的濃度，Ai為某待測成分的峰面積，ci為某待測成分的濃度[21]），結果見表6。

2.5.2 相對校正因子的適用性考察 考察Dionex Ultimate 3000、Shimadzu LC-20AT、Agilent 1260等3種高效液相色譜系統和col 10[Venusil ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）]、col 2 [Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）]2根色譜柱的相對校正因子。結果，8種人參皂苷類成分在不同高效液相色譜儀和色譜柱的RSD均小于5%，見表7。

2.6 西洋參破壁飲片樣品中8種人參皂苷類成分的含量測定

取10批西洋參破壁飲片樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”色譜條件，進樣測定，記錄峰面積。然后采用相對校正因子法和外標法分別計算8種人參皂苷類成分含量。結果，兩種方法測得的西洋參破壁飲片中8種人參皂苷類成分的相對誤差（RE）均小于3%，表明相對校正因子法與外標法差異不大，可對西洋參破壁飲片中上述8種成分進行準確定性和定量，見表8。

3 討論

在中藥質量控制和評價分析中，藥效成分的含量是其重要的評價指標;而基于中藥所含成分的復雜性，以多成分含量為質量控制指標的評價方法已被廣泛應用[8，14]。

西洋參中活性成分多樣，具有抗腫瘤、免疫調節等藥理作用[5-6]。因其較為名貴，常將其制成破壁飲片，以有效地利用其藥效成分。目前，2020年版《中國藥典》（一部）以人參皂苷Rg1、Re、Rb1作為該飲片質量控制的指標，并采用外標法進行含量測定。但是，僅測定這3種成分，并不能全面反映西洋參的內在質量;且以外標法測定多成分含量時，所需對照品的價格較高，使用量也較大，操作條件的穩定性和進樣量的重現性要求也較高?；诖?，本課題組采用孫磊等[15]提出的“雙標多測法”測定西洋參破壁飲片中8種人參皂苷類成分的含量。首先通過DRS Origin 軟件對13根色譜柱采集數據擬合進而對色譜峰定位;確定雙標化合物后，再用雙標線性校正法預測目標化合物的保留時間，從而達到定性目的。定量方面則結合相對校正因子法，并以人參皂苷Re為參照物進行計算。同時，筆者還將相對校正因子法與常規外標法測得的含量結果進行對比。結果發現，利用雙標多測法所測定的西洋參破壁飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd的含量分別為10.59～12.78、2.160～2.768、27.492～38.880、3.154～4.018、3.368～4.080、0.343～0.755、 0.961～1.415、5.857～6.923 mg/g，且與外標法所測得的含量的RE均小于3%，表明兩種方法含量測定結果無明顯差異。

綜上所述，所建立的雙標多測法可對西洋參破壁飲片中8種人參皂苷類成分進行準確定性和定量，后續可為該飲片多指標成分綜合質量控制和評價提供方法基礎。

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（收稿日期：2020-12-23 修回日期：2021-04-12）

（編輯：唐曉蓮）