基于生物信息學(xué)方法探討白花蛇舌草-半枝蓮抗乳腺癌的分子機(jī)制

張譽(yù)寶 孫長崗

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266033； 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院)

目前在全球范圍內(nèi)，乳腺癌(BC)患者約占所有癌癥患者總數(shù)的1/3，是僅次于肺癌的女性第2大癌癥死亡原因[1]。盡管包括放射療法、化學(xué)療法、手術(shù)和新輔助療法在內(nèi)的治療方法已經(jīng)獲得顯著成效，患者的存活率逐漸提高，但是由于副作用和多藥耐藥性等問題，高復(fù)發(fā)率和長期死亡率仍然嚴(yán)重威脅著患者健康[2-3]。因此臨床迫切需要副作用低的新型治療方法。

白花蛇舌草(HDW)作為一種傳統(tǒng)中草藥，主要功效包括清熱、排毒和祛瘀。由于具有顯著的抗腫瘤功效，在臨床上已廣泛用作多種腫瘤治療的替代藥物[4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，HDW可通過Akt/ERK信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長[5]；其提取物可以通過Ca2+/鈣蛋白酶/caspase-4途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[6]。半枝蓮(SB)是臨床中癌癥治療效果比較顯著的常用藥物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等多種作用[7]。HDW-SB

是中醫(yī)治療BC的常用藥對，在中醫(yī)治療癌癥的多種方劑中，均可見這兩種藥物的配伍使用，如“二白二半湯”、“肺癌輔助治療方”及“腫瘤和方”等方劑中[8-9]。其提取物可通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路，發(fā)揮抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)作用[10]。與單獨(dú)使用一種藥物相比，HDW和SB配伍使用增強(qiáng)了抗腫瘤功效[11]，但具體的分子生物學(xué)機(jī)制并不明確。因此，本研究旨在通過構(gòu)建藥靶可視化網(wǎng)絡(luò)并結(jié)合分子對接技術(shù)探討HDW-SB治療BC的分子機(jī)制，為HDW-SB的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 篩選HDW-SB共同有效成分及有效成分潛在靶點(diǎn)基因

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)[12]獲取HDW-SB的共同有效成分，篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似度(DL)≥0.18。通過TCMSP的靶點(diǎn)模塊篩選出HDW-SB共同有效成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，去重后，經(jīng)Perl(https://www.perl.org/)和UniProt(http://www.UniProt.org/)轉(zhuǎn)換為基因名稱，獲得HDW-SB有效成分的潛在靶點(diǎn)基因。

1.2 篩選BC組織與癌旁正常組織差異表達(dá)基因(DEGS)

通過基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取芯片GSE45827(包含130個BC組織樣本和11個癌旁正常組織樣本)，通過R平臺的limma軟件包篩選出BC組織與癌旁正常組織DEGs，篩選條件為|log2FC|≥1和P<0.05。再通過該平臺的R包提取HDW-SB共同有效成分與BC DEGs的交集，以確定HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將HDW-SB共同有效成分的潛在靶點(diǎn)基因和HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)全部輸入到STRING數(shù)據(jù)庫[13]中進(jìn)行分析，預(yù)測兩者的相互作用，最小相互作用閾值為0.400，物種為“智人”。將得到的相互作用數(shù)據(jù)再輸入Cytoscape 3.7.1軟件中[14]，分別構(gòu)建以下網(wǎng)絡(luò)：①BC DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)；②HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。使用CytoNCA插件對HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的所有基因進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y(jié)果排序后，選取前15位的靶點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用Cytoscape 3.7.1中的插件Clue Go對候選靶點(diǎn)從生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)以及分子功能(MF)3個層面進(jìn)行GO富集分析，然后使用DAVID數(shù)據(jù)庫[15]進(jìn)行KEGG通路分析。結(jié)果均以P<0.05為具有生物學(xué)意義的臨界值。

1.5 預(yù)后價值分析

用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫(含有5 143例BC組織樣本)評估候選靶點(diǎn)對患者總生存率(OS)和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)的影響，獲得與不良預(yù)后密切相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 分子對接分析

用PubChem數(shù)據(jù)庫(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取HDW-SB共同有效成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式；利用RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[16](https://www.rcsb.org/)收集關(guān)鍵靶點(diǎn)所對應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)信息；通過SYBYL-X軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)所對應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)和HDW-SB有效成分的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接分析，篩選核心有效成分，以對接分?jǐn)?shù)>4認(rèn)為具有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 HDW-SB共同有效成分及有效成分潛在靶點(diǎn)基因篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出HDW有效成分37種，SB有效成分94種，去重后得到25種HDW-SB共同有效成分，經(jīng)TCMSP的靶點(diǎn)模塊篩選并構(gòu)建HDW-SB共同有效成分及其潛在靶點(diǎn)基因的關(guān)系圖(圖1)。圖中左邊為HDW-SB共同有效成分，右邊部分為有效成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)基因。

圖1 HDW-SB共同有效成分及其潛在靶點(diǎn)基因關(guān)系圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過limma包分析獲得BC組織與癌旁正常組織DEGs 544個，包括185個上調(diào)基因和359個下調(diào)基因。通過CytoScape 3.7.1軟件構(gòu)建BC DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，包含150個節(jié)點(diǎn)和599條邊緣(節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連線)，其中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表低表達(dá)的基因，紅色節(jié)點(diǎn)代表高表達(dá)的基因，節(jié)點(diǎn)的直徑隨邊緣數(shù)量增加而增大。通過R包對HDW-SB共同有效成分和BC DEGs取交集，顯示有15種HDW-SB共同有效成分調(diào)控了BC相關(guān)的23個潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，其中紅色節(jié)點(diǎn)表示HWD-SB共同有效成分，藍(lán)色六邊形節(jié)點(diǎn)代表HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)，共有44條邊緣。將上面所獲得的23個靶點(diǎn)通過Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治龊螅挥谇?5位的靶點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)蛋白，分別為ESR1、EGFR、AR、RUNX2、CCNA2、PRKCD、CHECK2、CHEK1、HSPB1、SERPINE、GSTP1、FOS、NQO1、COL1A1及ODC1。

A:BC DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,B：HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖圖2 BC DEGs及HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 候選靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路分析

GO富集分析結(jié)果顯示，HDW-SB候選靶點(diǎn)在BP層面主要富集于活性氧的反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面。MF層面主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)劑活性、RNA聚合酶Ⅱ基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活劑結(jié)合等方面。CC層面主要富集于囊泡腔、基底膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等方面。KEGG通路分析顯示，HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)主要富集于雌激素信號傳導(dǎo)途徑、MAPK信號通路、細(xì)胞周期、趨化因子信號通路等關(guān)鍵通路(P<0.05)。

2.4 預(yù)后價值分析

對BC的15個候選靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)后價值分析顯示，HSPB1、CCNA2及NQO1與患者的OS和RFS密切相關(guān)，為與不良預(yù)后密切相關(guān)的BC關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 HDW-SB有效成分與BC靶點(diǎn)蛋白的分子對接分析

對關(guān)鍵靶點(diǎn)HSPB1、CCNA2和NQO1以及HDW-SB共同有效成分進(jìn)行分子對接分析后顯示， HDW-SB共同有效成分中quercetin、rhamnoside以及l(fā)uteolin與BC關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接分?jǐn)?shù)最高；quercetin、rhamnoside和luteolin與HSPB1的對接分?jǐn)?shù)分別為4.26、4.75、4.57；quercetin、rhamnoside以及l(fā)uteolin與CCNA2的對接分?jǐn)?shù)分別為5.41、4.71、5.70；quercetin、rhamnoside和luteolin與NQO1的對接分?jǐn)?shù)分別為4.41、4.88、4.77。

3 討 論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法結(jié)合分子對接技術(shù)，揭示HDW-SB共同有效成分及其治療BC的分子機(jī)制。首先通過構(gòu)建BC DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)和HDW-SB共同有效成分所調(diào)控的BC靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出23個藥物和疾病的共同靶點(diǎn)，再經(jīng)拓?fù)浞治鰪闹泻Y選出15個候選靶點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行預(yù)后價值分析后顯示，HSPB1、CCNA2和NQO1 3個靶點(diǎn)均與BC患者的OS以及RFS密切相關(guān)，可能是HDW-SB治療BC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

對KEGG通路分析顯示，MAPK信號通路與雌激素信號通路與BC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。先前研究表明，雌激素信號通路是參與ER+乳腺癌治療的重要通路之一，也是正常乳腺發(fā)育和乳腺癌發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路[17-18]。多細(xì)胞生物中細(xì)胞增殖的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，MAPK通路涉及一系列蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。此外，MAPK家族包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、Jun激酶(JNK/SAPK)和p38 MAPK，這些活化的激酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、增殖、遷移以及凋亡，從而被認(rèn)為是癌癥治療的潛在治療途徑[20]。

HDW-SB的有效成分quercetin是一種類黃酮化合物，廣泛存在于天然植物中，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化以及抗癌功效[21]。研究發(fā)現(xiàn)，quercetin可以有效抑制細(xì)胞周期蛋白1、p21、Twist以及磷酸化的p38 MAPK的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡[22]。Survivin為凋亡抑制蛋白家族的成員，與腫瘤的惡性程度和病理分型有關(guān)，其表達(dá)升高預(yù)示著患者的預(yù)后不良。研究表明quercetin可通過降低survivinmRNA的表達(dá)水平來提高BC細(xì)胞對化療的敏感性[23]。HDW-SB的有效成分rhamnoside具有顯著的抗血管生成特性，其可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)激酶的活化和磷酸化進(jìn)程，從而對下游MAPK、絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和信號轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)起到抑制作用[24]。在癌癥進(jìn)展過程中，VEGFR2在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和通透性中起著非常重要的作用[25]，其激活后可促進(jìn)多種下游信號分子的磷酸化，包括MAPK、AKT和STAT3，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管形成[26]。同時，rhamnoside還可以通過抑制VEGFR2及其下游信號調(diào)節(jié)因子的磷酸化，從而抑制腫瘤的新生血管生成，另外，luteolin是一種常見的類黃酮化合物，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和新生血管生成[27]。目前研究顯示，luteolin可通過下調(diào)PI3K/AKT和MAPK/ERK通路抑制BC細(xì)胞的生長[28]。在本研究中，HDW-SB的有效成分quercetin、rhamnoside和luteolin與BC關(guān)鍵靶點(diǎn)對接分?jǐn)?shù)最高，因此推測這3種有效成分可能是HDW-SB治療BC的核心有效成分。

研究報道，HSPB1屬于小應(yīng)激蛋白家族，在IDCA乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)，主要參與調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，可以通過與細(xì)胞質(zhì)受體(VEGF、FGF-2、Her2)的相互作用促進(jìn)組成性細(xì)胞分裂，進(jìn)一步導(dǎo)致MAPK/MEK/ERK通路的過度活化[29]。CCNA2在各種腫瘤中均呈現(xiàn)過表達(dá)，是高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族成員之一。研究表明，在HT-29和HCT116大腸癌細(xì)胞系中敲除CCNA2基因后，可顯著阻滯大腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并直接抑制大腸癌細(xì)胞的生長，也許該基因可有望成為大腸癌的新的生物標(biāo)志物[30]。NQO1過表達(dá)與乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、肺癌和胰腺癌的預(yù)后不良密切相關(guān)，并可通過上調(diào)X連鎖凋亡蛋白(XIAP)的穩(wěn)定性來抑制肝癌細(xì)胞的凋亡[31]。本文研究結(jié)果亦顯示，HDW-SB有效成分中的quercetin、rhamnoside和luteolin與上述3個關(guān)鍵靶點(diǎn)均呈現(xiàn)出較高的對接分?jǐn)?shù)，提示HDW-SB可能是通過調(diào)節(jié)HSPB1、CCNA2和NQO1發(fā)揮抗BC的作用。

總之，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)與分子對接技術(shù)相結(jié)合的方法，全面分析了HDW-SB共同有效成分治療BC的分子機(jī)制，為揭示多組分中藥的治療機(jī)制提供了一種新的研究思路。