基于網絡藥理學、分子對接及分子動力學探討 秦艽-桑枝治療類風濕關節炎的機制

肖劍偉 蔡旭 郭粉蓮 黃新民 尹志華 汪榮盛

〔摘要〕 目的 通過網絡藥理學及分子對接、分子動力學探討秦艽-桑枝治療類風濕關節炎（RA）的活性成分、作用靶點及作用機制。方法 通過中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）檢索秦艽、桑枝的成分及作用靶點基因;將藥對的作用靶點與GeneCards數據庫檢索所得的疾病靶基因取交集;根據交集結果進行GO功能富集和KEGG通路分析;通過Cytoscape得出核心基因;并選擇PTGS2、CASP3、RELA等靶基因與秦艽、桑枝的活性成分山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷運用AutoDock Vina進行分子對接;通過Gromacs軟件進行分子動力學模擬。結果 共篩選出秦艽-桑枝與RA共同靶基因90個。GO功能富集分析主要集中于對腫瘤壞死因子的反應、細胞調亡的調節、類固醇激素受體活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合等。KEGG分析顯示主要富集于TNF信號通路、調亡通路、IL-17信號通路、破骨細胞分化、類風濕關節炎等信號通路。分子對接及分子動力學結果顯示藥對的活性成分山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷能夠與PTGS2、CASP3、RELA等靶基因緊密對接，形成穩定作用。結論 秦艽、桑枝的有效成分山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷可能通過作用于PTGS2、CASP3等靶基因，影響炎癥因子釋放及RA滑膜成纖維細胞的凋亡而發揮治療RA的作用。

〔關鍵詞〕 類風濕關節炎;分子對接;秦艽;桑枝;分子動力學;信號通路

〔中圖分類號〕R255.6? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.008

Mechanisms for the Treatment of Rheumatoid Arthritis with Qinjiao （Gentianae Macrophyllae Radix）-Sangzhi （Mori Ramulus） Based on Network Pharmacology， Molecular Docking

and Molecular Dynamics

XIAO Jianwei1， CAI Xu1， GUO Fenlian1， HUANG Xinmin1， YIN Zhihua1， WANG Rongsheng2*

（1. Shenzhen Futian Hospital for Rheumatic Diseases， Shenzhen， Guangdong 518000， China;

2. Shanghai Guanghua Hospital of Integrated Traditional and Western Medicin， Shanghai 200052， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the ingredients， target and mechanism of rheumatoid arthritis （RA） treated with Qinjiao （Gentianae Macrophyllae Radix）-Sangzhi （Mori Ramulus） by network pharmacology， molecular docking and molecular dynamics. Methods The ingredients and target genes of Qinjiao （Gentianae Macrophyllae Radix） and Sangzhi （Mori Ramulus） were searched through the Chinese medicine system pharmacology technology platform （TCMSP） and PharmMapper website， the intersection of the target of the drug pair and the disease target gene retrieved from the GeneCards database was taken， then gene ontology （GO） enrichment and KEGG pathway analysis based on the intersection results were performed. The Hub gene was obtained through Cytoscape. PTGS2， CASP3 and RELA with the active ingredients of Qinjiao （Gentianae Macrophyllae Radix）-Sangzhi （Mori Ramulus） including kaempferol， β-sitosterol and gentiopicroside were selected for molecular docking by AutoDock Vina. Molecular dynamics simulation was carried out by Gromacs software.? Results A total of 90 crossed target genes of Qinjiao （Gentianae Macrophyllae Radix）-Sangzhi （Mori Ramulus） and RA were identified. GO functional enrichment analysis mainly focused on the response to tumor necrosis factor， regulation of cell death， steroid hormone receptor activity， tumor necrosis factor receptor superfamily binding， etc. KEGG analysis showed that it was mainly enriched in TNF signaling pathway， apoptosis， IL-17 signaling pathway， osteoclast differentiation， rheumatoid arthritis， etc. The results of molecular docking and molecular dynamics showed that the active ingredients kaempferol， β-sitosterol and gentiopicroside of the drug pair can be closely docked with PTGS2， CASP3 and RELA， and to form a stable effect. Conclusion The effective ingredients kaempferol， β-sitosterol and gentiopicroside of Qinjiao （Gentianae Macrophyllae Radix）-Sangzhi （Mori Ramulus） may play a therapeutic role to affect the release of inflammatory factors and apoptosis of RA synovial fibroblasts by acting on the target genes such as PTGS2 and CASP3.

〔Keywords〕 rheumatoid arthritis; molecular docking; AutoDock Vina; Qinjiao-Sangzhi; R software; molecular dynamics

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以慢性炎癥和骨損傷為特征的自身炎癥性疾病，其患病率約為0.5%～1%，其中，女性的發病率是男性的2～3倍[1]。其反復的滑膜炎癥，最終導致關節軟骨和骨損傷，從而出現功能限制、工作障礙和生活質量低下。

從中醫學角度分析，RA患者大多屬于中醫學“尪痹”范疇，通過對李其忠教授主編的《丁甘仁學術經驗集》病案分析[2]，在丁甘仁21例痹癥類醫案中，使用頻率較高的單個藥物為秦艽、桑枝、當歸，藥對為秦艽-桑枝、桑枝-當歸、桑枝-丹參，其中，使用頻率最高的藥對為秦艽-桑枝。在實際應用中，時常與羌活、桂枝等合用以祛風除濕，如蠲痹湯。國醫大師劉祖貽治療RA亦時常選用秦艽、桑枝[3]。臨床研究[4-5]顯示，以秦艽、桑枝為主要成分的蠲痹湯、祛風除痹膠囊等藥方對RA均有明顯的療效。提示該藥對在治療RA中可能具有重要的作用。

分子對接技術是預測小分子配體與受體相互作用機制的模擬化手段，網絡藥理學是融合生物信息學和系統藥理學為一體的學科[6]，因為網絡藥理學及分子對接提供了對網絡理論和系統生物學的更完整的理解，被認為是藥物發現的下一個范例[7]。分子動力學是一門綜合了物理、數學和化學技術的分子模擬方法[8]。本課題組利用網絡藥理學、分子對接、分子動力學等多種生物信息分析方法，通過篩選秦艽-桑枝成分類藥性、預測作用靶點等，從藥對中篩選出與RA靶基因有相互作用的有效成分，對篩選后的有效成分與靶基因進行分子對接及水溶液中動力學模擬，預測藥物小分子有效成分與靶基因的結合位點，為探索秦艽-桑枝對RA的作用機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1? 藥對有效成分篩選及作用靶點預測

采用中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[9]檢索桑枝、秦艽的化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性（drug likeness， DL）≥0.18作為活性化合物的篩選條件篩選出有效小分子成分。而在TCMSP未查詢到作用靶點的小分子成分，通過PharmMapper網站（www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）查詢得到其排名前40的預測作用靶點[10]。將TCMSP、PharmMapper搜索得到活性成分對應的相關靶點蛋白名，通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）查找物種為人類的對應官方基因名，刪除重復項的潛在作用靶點，通過Cytoscape 3.7.1軟件繪制藥物-化合物-靶基因網絡圖。

1.2? RA靶點搜集

以“Rheumatoid Arthritis”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org/）與RA相關的疾病靶點。

1.3? 治療靶點獲取及韋恩圖繪制

通過FunRich 3.1.3軟件對“1.1”及“1.2”步驟獲得的靶基因取交集，并繪制韋恩圖，得到秦艽-桑枝治療RA的潛在作用靶點。

1.4? 靶點生物學功能、通路及蛋白相互作用網絡分析

使用R軟件的org.Hs.eg.db、clusterProfiler等R包，以P<0.05為篩選條件，對差異基因行GO功能富集分析及KEGG信號通路分析。采用STRING在線數據庫[11]進行蛋白相互作用網絡分析，并通過Cytoscape 3.71軟件的CytoHub插件篩選核心基因（Hub基因）。使用KEGG 數據庫將凋亡相關蛋白映射到KEGG凋亡的通路（hsa04210）中。

1.5? 分子對接

從RCSB PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）中獲取基因靶點的晶體結構，使用PyMOL 2.4.1軟件除去晶體水，導入AutoDock Tools 1.5.6軟件并予加氫、加電荷處理，結果輸出為pdbqt格式。藥物小分子從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取并導入ChemBio3D Ultra 14.0軟件，其能量最小化，導入AutoDock Tools 1.5.6 軟件保存為pdbqt 格式。對接使用AutoDock Vina 1.1.2程序進行，使用半柔性對接方法，根據評分函數計算出的結合親和能，篩選出10個打分最高的構象模型，并選取結合能最小的配體作為最佳配體。將復合物導入Discovery Studio 2016軟件，計算兩者結合的氫鍵的距離及Pi鍵數量。

1.6? 分子動力學模擬

使用Gromacs 2019.5軟件進行動力學模擬。首先使用ATB網站（http：//atb.uq.edu.au/）[12]，將活性小分子轉換為分子結構文件（Gro格式），Gromacs內置命令將蛋白轉換為分子結構文件及生成拓撲文件。使用Gromos54a7_atb力場及SPC模型水分子，蛋白中的原子距離水盒子邊緣最小距離為10 ?。根據對接結果使用鈉離子或氯離子中和系統電荷。模擬溫度為300 K，模擬前采用最速下降法對體系進行50 000步的分子力學優化。接著對優化后的體系分別進行步長為2 fs，總時間長為100 ps的NVT和NPT系綜平衡，在平衡過程中對體系位置進行限制，最后在300 K的溫度下進行20 ns的分子動力學模擬，模擬時間間隔為2 fs。所產生的結果去除周期性邊界后使用GROMACS內置工具對生成的軌跡提取20 ns時最終結構，與模擬前復合物初始結構對齊后，對比其蛋白與小分子間的作用力;評估蛋白與小分子復合物的均方根偏差（root mean square deviation， RMSD），蛋白回旋半徑、溶劑可及表面（solvent accessible surface area， SASA）。使用MM-PBSA計算受體與配體的結合自由能。通過Pymol 2.4.1、VMD 1.9.3和Origin 2019軟件進行可視化。

2 結果

2.1? 秦艽-桑枝活性成分及作用靶基因

TCMSP篩選后得到OB≥30%和DL≥0.18的桑枝、秦艽的有效成分較少。根據文獻檢索結果顯示，桑枝的成分桑辛素、桑黃酮以及秦艽的成分齊墩果酸、苦味素、葡糖苷、龍膽苦苷、龍膽素、櫟櫻酸、香樹精雖然OB小于30%，但是其具有活性作用，故納入本研究[13-19]。結果顯示桑枝有效活性成分5個，秦艽8個。共同得到桑枝、秦艽有效小分子化合物的作用靶點133個。通過Cytoscape軟件將藥物、化合物和靶基因相連，繪制出藥物-化合物-靶基因相互作用網絡圖。分析該互作網絡拓撲結構，此網絡包含了148個節點和222條邊。見表1、圖1。

2.2? 共同靶基因及韋恩圖

通過GeneCards數據庫檢索到RA相關靶點3 437個，與桑枝-秦艽潛在作用靶基因取交集，得到共同靶基因90個。見圖2。

2.3? GO及KEGG分析結果

對“2.2”步驟得到的差異基因行GO富集分析，顯示其生物過程（biological process， BP）主要富集于對白細胞介素6生產的正調控、細胞調亡的調節、細胞內受體信號通路、免疫系統過程等;分子功能（molecular function， MF）富集于類固醇激素受體活性、藥物結合、TNF受體超家族結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等;細胞成分（cellular component， CC）顯示主要定位于質膜、內質網等。KEGG分析顯示主要富集于TNF信號通路、P53信號通路、自噬通路、IL-17信號通路、破骨細胞分化、RA等信號通路。主要調控的靶點有AKT1、JUN、RELA及凋亡相關蛋白CASP3等。見圖3。

2.4? 蛋白互作網絡及Hub基因

將STRING網站分析得到的90個靶點的蛋白互作關系數據導入Cytoscape軟件，繪制PPI網絡圖。此網絡共有83個節點、650條邊。通過Cytoscape的CytoHub插件篩選得到該網絡中度值排名前10 的靶蛋白（AKT1、JUN、MAPK8、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK14、RELA、EGFR、ESR1）。見圖4。

2.5? 分子對接結果

根據“2.1”結果，篩選得到兩味中藥的有效小分子化合物山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷共同作用的靶點CASP3;β-谷甾醇作用靶點PTGS2、JUN;山奈酚作用靶點PTGS2、RELA、AKT1和JUN;龍膽苦苷作用靶點MAPK1。將小分子及靶蛋白分別通過AutoDock Vina程序對分子對接的結果進行打分。結果顯示山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷通過氫鍵、疏水鍵與靶點結合，具有較強的結合能力，可能通過抑制其活性中心而改變其生物活性，從而達到治療RA的目的。見表2、圖5。

2.6? 分子動力學模擬結果

所有復合體在整個運行過程中均穩定。10個復合物體系的RMSD在10～15 ns左右時均達到平衡狀態。所有體系的RMSD波動值均小于0.2 nm。計算復合物體系的蛋白回旋半徑，結果均顯示其半徑隨著模擬的進行逐漸縮小，提示蛋白與小分子結合后結構穩定。SASA結果顯示，復合物體系SASA逐漸縮小，提示整個體系在模擬過程中逐漸趨于穩定。見圖6-8。

與模擬前對比，通過20 ns的動力學模擬，β-谷甾醇、山奈酚、龍膽苦苷依然能通過氫鍵、疏水鍵及Pi鍵與靶蛋白在活性口袋緊密結合。其中，β-谷甾醇與PTGS2、CASP3，龍膽苦苷與CASP3結合后，與模擬前對比，其在蛋白質結構內部移動幅度較大，這種相互作用可能會導致蛋白質的孔隙發生變化，從而抑制蛋白質的功能。并且其SASA變化較山奈酚復合物體系明顯，基于蛋白質結構的較大變化，β-谷甾醇、龍膽苦苷可能對PTGS2、CASP3有更強的作用。

山奈酚與PTGS2，龍膽苦苷與CASP3、MAPK1的結合主要通過范德華力和靜電勢能，而極性溶劑化作用則對結合起抑制作用。山奈酚與CASP3、RELA、AKT1、JUN，β-谷甾醇與PTGS2、JUN及CASP3的結合主要通過范德華力，而極性溶劑化作用則對結合起抑制作用。見表3。

3 討論

RA作為常見的風濕免疫疾病，長期困擾患者的生活，如治療不充分，RA會導致關節損傷和不可逆轉的殘疾。本研究以網絡藥理學、分子對接、分子動力學為基礎，構建了“秦艽-桑枝”藥對的藥物-成分-靶標網絡，并對多個靶點與山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷進行了分子對接和動力學模擬，為該藥治療RA的多成分、多靶點的作用機制提供了參考。

從中醫學角度分析，RA患者正氣不足，風寒濕邪氣乘虛入里，痹阻關節筋脈是其主要的病機。桑枝具有祛風濕、行水、利關節之功效;而秦艽具有祛風濕、通經絡、清虛熱、利尿退黃等功效。兩者俱為祛風濕藥，聯合使用具有通絡止痛、緩解癥狀的作用。現代藥理研究[20]顯示，桑枝的有效成分山奈酚能夠抑制RA滑膜成纖維樣細胞（fibroblast-like synoviocytes， FLS）的增殖，誘導細胞凋亡，并減輕炎癥。Pan等[21]研究顯示山奈酚可通過阻斷MAPK通路的激活而不影響腫瘤壞死因子（TNF-α）受體的表達來抑制RA中FLS的遷移和侵襲，同時還可以顯著抑制TNF-α誘導的MAPK活化，減輕膠原誘導小鼠的關節炎嚴重程度。研究[22]顯示，桑辛素和桑黃酮對PTGS2活性有抑制作用。β-谷甾醇可明顯降低佐劑型關節炎大鼠血清和組織中的TNF-α、C-反應蛋白、IL-2的含量[23]，還能顯著抑制M1巨噬細胞極化并增強M2巨噬細胞極化，從而減輕佐劑型關節炎小鼠的癥狀[24]。齊墩果酸能夠通過下調絲氨酸/蘇氨酸激酶，絲裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB（NF-κB）來降低RA中FLS炎性介質的表達和產生[25]。龍膽苦苷能夠通過抑制FLS中的ROS-NF-κB-NLRP3軸來抑制炎癥因子白介素6（interleukin 6， IL-6）的產生，從而緩解RA的癥狀[21]。以上研究結果與本研究GO富集分析及KEGG分析結果是相吻合的。

分子對接及分子動力學結果顯示，山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷均能夠緊密對接各個靶點，且很快達到穩態。其中，范德華力在多個復合物體系的結合中起著重要作用。PTGS2又稱為COX-2，在受到各種刺激時表達上調，參與多種病理過程，與炎癥、腫瘤的發生、發展均存在密切關系。PTGS2能誘導產生前列腺素E2（prostaglandin E2， PGE2），從而在RA中導致炎癥和疼痛。FLS釋放PGE2是由促炎性細胞因子觸發的[26]。PGE2還能誘導PI3K信號通路的激活，協同誘導組胺和IL-6釋放。組胺刺激血管通透性，IL-6促進中性粒細胞募集，從而加重炎癥，通過抑制PTGS2就能減少PGE2的釋放從而控制炎癥反應。研究[27]顯示，RA關節的損害與滑膜細胞過度增生及凋亡不足是密切相關的。FLS的異常激活，導致了各種炎癥因子的釋放、血管翳的形成，繼而出現骨質破壞，進一步加重了RA患者的臨床癥狀。CASP3為半胱氨酸蛋白酶家族成員，通過裂解多種關鍵的細胞蛋白在凋亡途徑中發揮關鍵作用。正常情況下，CASP3在細胞胞質中以無活性的酶原形式存在，通過級聯反應使CASP3被活化，將凋亡的級聯反應進行下去導致細胞發生凋亡[28]。例如周文旭等[29]發現，甲氨蝶呤可誘導RA滑膜細胞CASP3活化，促進滑膜細胞的凋亡，從而抑制關節滑膜細胞的增殖，減輕滑膜增厚而發揮治療作用。RELA又稱為NF-κB p65，在RA患者中，NF-κB活性均高于對照組，且和凋亡相關蛋白呈正相關，提示其在凋亡通路里面扮演了重要的角色[30]。AKT1是P13K/AKT 通路的重要組成部分，活化的AKT通過上調細胞周期蛋白，以多種途徑調節凋亡[31]。研究[32]證明，JUN可以通過上調抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-3，進而阻止T細胞凋亡。MAPK1又稱為ERK2，可被炎癥因子等激活，對細胞的生長、增殖等發揮重要作用[33]。RA滑膜中ERK的異常活化可促進滑膜細胞炎癥反應，并參與滑膜細胞過度增殖及凋亡抑制，同時可增加基質降解酶的產生，在關節破壞方面發揮重要作用[34]。以上結果提示，山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷可能通過調控多個與炎癥、凋亡密切相關的信號通路，促進RA滑膜成纖維細胞的凋亡，減少炎癥因子的釋放，是RA的潛在治療靶點。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學、分子對接及分子動力學方法研究秦艽-桑枝有效活性成分山奈酚、β-谷甾醇、龍膽苦苷治療RA的機制，為進一步從秦艽-桑枝中提取有效活性成分治療RA提供了理論依據。然而，本研究僅是基于分子對接機制的預測，課題組后期將開展相關的驗證，通過實驗驗證其作用機制。

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