間充質(zhì)干細胞來源外泌體修復創(chuàng)傷性脊髓損傷

周麗 孔彥龍 陶欣榮

摘 要：創(chuàng)傷性脊髓損傷能夠引起嚴重的神經(jīng)功能障礙，是一種嚴重影響生活質(zhì)量的疾病，但是尚無有效的治療方法?，F(xiàn)有研究中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具有和母細胞相似的生理作用，將外泌體應(yīng)用于脊髓損傷的治療中表現(xiàn)出令人滿意的療效，而且移植外泌體后尚未發(fā)現(xiàn)在移植干細胞中出現(xiàn)的致瘤等副作用，因此外泌體將會是脊髓損傷治療中一個很有前景的策略。現(xiàn)將間充質(zhì)干細胞來源外泌體在治療創(chuàng)傷性脊髓損傷中的研究進展進行綜述，分析目前存在的問題和未來的研究方向。

關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細胞;外泌體;創(chuàng)傷性脊髓損傷;再生修復

中圖分類號： 392.4? 文獻標志碼：A

文章編號：1672-1098（2021）01-0075-06

收稿日期：2020-09-20

基金項目：淮南市指導性科技計劃資助項目（2020B026）;安徽理工大學研究生創(chuàng)新基金資助項目（2019CX2070，2019CX2069）

作者簡介：周麗（1995-），女，江西九江人，在讀碩士，研究方向：神經(jīng)免疫。

Exosomes Derived from Mesenchymal Stem Cells Repairing Traumatic Spinal Cord Injury

ZHOU Li， KONG Yanlong， TAO Xinrong

（Medical College of Anhui University of Science and Technology， Huainan Anhui 232001，China）

Abstract：Traumatic spinal cord injury， which will cause serious neurological dysfunction， is a disease that seriously affects the quality of life， but there are no effective treatments. In present studies， it has been found that the exosomes derived from mesenchymal stem cells have similar physiological effects to mother cells， and the application of such exosomes in the treatment of spinal cord injury shows satisfactory curative effect. Moreover， side effects such as tumorigenesis happened in transplanting stem cells have not been found in transplanting the exosomes until now， therefore this method of transplanting exosomes will be a promising strategy in therapy of spinal cord injury. Here is a review to analyze existing problems and future direction in research of exosomes derived from mesenchymal stem cells in the treatment of traumatic spinal cord injury.

Key words：mesenchymal stem cells; exosomes; traumatic spinal cord injury; regenerative repair

創(chuàng)傷性脊髓損傷（Traumatic Spinal Cord Injury， TSCI）在交通事故以及高空墜落傷中常見，極易引起癱瘓等并發(fā)癥，且難以治愈，給患者、家屬及社會帶來巨大的經(jīng)濟和心理負擔[1]。1992年，大劑量甲基強的松龍沖擊療法首次被用于治療急性TSCI，并被推廣應(yīng)用[2]，但由于嚴重的副作用限制了其作用的發(fā)揮。后來研究發(fā)現(xiàn)移植骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells， BMSCs）[3]、臍帶間充質(zhì)干細胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）[4]、胚胎干細胞[5]等能夠減少神經(jīng)細胞死亡，促進髓鞘再生，有利于感覺運動功能的恢復，但也因為倫理等問題影響了其進一步研究。有學者將間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的外泌體（exosomes， Exo）通過尾靜脈移植到TSCI小鼠體內(nèi)，觀察到明顯的損傷修復作用，這和移植間充質(zhì)干細胞的修復效果相似[6]1 552，而且沒有出現(xiàn)細胞移植的各種弊端，顯示出間充質(zhì)干細胞來源的外泌體（MSCs-Exo）治療TSCI的巨大潛力，但是MSCs-Exo促進損傷修復的機制仍未完全闡明。此外，雖然在不同的實驗中都顯示出一定的損傷修復作用，但是移植MSCs-Exo的途徑、移植劑量和移植時間與損傷修復作用之間的關(guān)系尚缺乏足夠的關(guān)注。因此本文通過近些年國內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)文獻對上述問題以及MSCs-Exo促進TSCI修復的可能機制進行闡述。

1 MSCs-Exo移植

1.1 移植途徑

目前TSCI的試驗中移植MSCs-Exo的方法主要有三種，即靜脈注射、鼻腔給藥和損傷局部應(yīng)用。靜脈移植的實驗中主要采用尾靜脈注射，文獻[7]3 389將MSCs-Exo通過尾靜脈注射到模型鼠體內(nèi)后，觀察到促凋亡蛋白（Bax）和促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β）的表達水平降低，但抗凋亡蛋白（Bcl-2）和抗炎細胞因子（IL-10）的表達量明顯升高，且在注射后第7d后肢運動功能評分（BBB評分）與對照組出現(xiàn)顯著性差異。文獻[8]10 024將標記的MSCs-Exo分別經(jīng)鼻腔和損傷局部給藥，24h后通過Micro-CT觀察損傷部位的熒光強度，發(fā)現(xiàn)損傷局部給藥組熒光更強，在第14d BBB評分與對照組出現(xiàn)差異，而且在28d的試驗周期中，雖然兩種移植途徑都能夠產(chǎn)生修復效果，但是最后還是以損傷局部應(yīng)用引起的運動能力改善更加明顯。所以，通過以上3種途徑移植MSCs-Exo均能夠?qū)SCI產(chǎn)生修復效果。尾靜脈移植實驗操作相對簡便，是目前最常用的移植途徑，不過注射到體內(nèi)的MSCs-Exo要經(jīng)歷體循環(huán)過程和血脊髓屏障（Blood-Spinal Cord Barrier，BSCB），會降低到達損傷部位的MSCs-Exo的量，但是目前尚沒有這方面的研究。而鼻腔移植的優(yōu)勢在于能夠使EX更快通過BSCB，且避免了體循環(huán)過程，似乎是比較理想的移植途徑，但在移植過程中真正進入體內(nèi)的MSCs-Exo的量無法確定，存在很多不確定性，限制了其被廣泛采用。在上述尾靜脈注射和鼻腔給藥的實驗中可看到，理論上能夠更快通過BSCB的鼻腔給藥組卻比尾靜脈注射組的運動功能改善效果差，原因可能就是鼻腔給藥過程中損失掉了一部分MSCs-Exo，導致透過BSCB到達損傷部位的MSCs-Exo總量減少，因此影響了修復效果。損傷局部應(yīng)用在上述實驗中表現(xiàn)出良好的修復作用，但是由于存在二次損傷等風險限制了其使用。從上述實驗中能夠看出移植途徑對運動功能改善的影響，但是仍缺乏有力的證據(jù)，后續(xù)研究中應(yīng)該關(guān)注此部分的探索。

1.2 移植劑量

當前有關(guān)移植MSCs-Exo的劑量沒有明確的規(guī)定。文獻[9]3 694通過尾靜脈注射的劑量為100μg MSCs-Exo蛋白，在第7d觀察到運動功能改善。但在相同的劑量下，文獻[10]4在第14d觀察到運動功能改善。而文獻[11]472、文獻[12]注射的劑量為200μg BMSCs-Exo蛋白，前者在第7d觀察到運動功能改善，后者在第14d觀察到運動功能改善。文獻[13]172注射的劑量則為100mg BMSCs-Exo蛋白，在第7d觀察到運動功能改善。文獻[8]10 024在鼻腔給藥和局部給藥的過程中應(yīng)用的劑量均為40μg BMSCs-Exo蛋白，前者在第14d首先觀察到短暫的運動功能改善，后者運動功能改善出現(xiàn)較晚但是功能恢復更加明顯。由上述實驗可知即使移植劑量相同，實驗結(jié)果也不完全相同，這可能與移植途徑以及移植次數(shù)和時間等有關(guān)。此外，不同的移植途徑中，靜脈移植相對于鼻腔給藥和局部應(yīng)用需要的劑量更大。但是這不能掩蓋現(xiàn)階段對于移植MSCs-Exo的劑量尚沒有統(tǒng)一量化標準的事實。目前的實驗主要通過測定MSCs-Exo中的蛋白含量來量化外泌體的移植劑量，但通過前期研究可知MSCs-Exo中有很多不同的成分，文獻[14]通過高通量測序和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學在豬脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體中檢測出4種 miRNA、255種 mRNA和277 種蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)中就含有能夠促進軸突生長的肝細胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β等。文獻[15]在BMSCs-Exo中檢測出各種粒細胞集落刺激因子、IL-6等能夠抑制炎癥反應(yīng)的成分，可見外泌體的成分非常之復雜。MSCs-Exo中含有的RNA對脊髓損傷也有一定的修復作用，文獻[16]將富含miR-25的BMSCs-Exo移植到脊髓損傷小鼠后觀察到小鼠運動功能的改善。所以，單純通過蛋白含量定量MSCs-Exo的方法就有失科學性，而且MSCs產(chǎn)生Exo的量和MSCs的狀態(tài)也有一定關(guān)系，因此在定量MSCs-Exo的問題上還需要深入研究。

1.3 移植時間

TSCI后移植MSCs-Exo的最佳時間尚沒有專門研究過，在已有實驗中造模成功0h[11]472、0.5h[7，17]3 389，2、1h[9-10]3 695，3、3h[8]10 017、24h[13]172或7d[19]移植MSCs-Exo都有報道， 不同實驗中模型鼠的感覺運動功能均出現(xiàn)不同程度的改善， 但是以3h以內(nèi)移植 MSCs-Exo的實驗組感覺運動功能恢復更加明顯，在7d左右就出現(xiàn)了后肢BBB評分的升高。在TSCI的病理生理變化中有學者提到，脊髓損傷后1hTNF-α水平升高、2～3h白三烯和血栓素等其他炎性細胞因子水平升高5～9倍，因此，在SCI后3h以內(nèi)是降低損傷部位炎癥水平的最佳時期[19-20]。而在上述研究中也發(fā)現(xiàn)3h以內(nèi)移植MSCs-Exo能夠取得非常明顯的神經(jīng)功能恢復，兩者的結(jié)論相互吻合。另一方面，運動功能恢復快慢似乎和治療的持續(xù)時間也有關(guān)系，文獻[8]10 020對注射1次載有張力蛋白同源物小干擾RNA的MSCs-Exo（Exo-PTEN）和注射5次Exo-PTEN的TSCI小鼠模型進行比較，8周后發(fā)現(xiàn)注射5次的模型鼠運動功能明顯改善，BBB評分7.75±2.14，注射1次的模型鼠BBB評分2.50±1.21，而且感覺恢復也以注射5次的ExoPTEN組最為明顯。這些結(jié)果提示移植MSCs-Exo治療TSCI可能需要多次治療而不是目前很多研究中采用的單次治療。所以，在移植MSCs-Exo治療TSCI時最佳的治療時間是在損傷后3h內(nèi)開始治療，并且進行多次治療。

2 MSCs-Exo促進TSCI修復可能機制

2.1 抑制神經(jīng)細胞凋亡

TSCI后損傷部位的水腫、出血等能夠使神經(jīng)細胞死亡，隨后引起的損傷部位細胞因子、miRNAs等的變化進一步加重了神經(jīng)細胞凋亡。有研究顯示，脊髓損傷后損傷部位大約有30種miRNA的含量發(fā)生了變化[21]146，例如miR-133b[22]53和miR-124[23]的下調(diào)，miR-20[24]和miR-103[21]149的上調(diào)。另外還有研究表明脊髓損傷后谷氨酸（GLU）大量存在于損傷的神經(jīng)元周圍，這是導致神經(jīng)細胞凋亡的重要原因之一[25]。文獻[26]在體外實驗中觀察到MSCs-Exo能夠抑制GLU引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的凋亡，并且使促凋亡蛋白，如Bax、活化的caspase-3和caspase-9含量降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2等含量增加，在體內(nèi)實驗中，將MSCs-Exo直接注射到SCI損傷部位，在治療后第1d就觀察到神經(jīng)細胞凋亡率降低，同時也觀察到和體外實驗中相同的蛋白水平變化，并且對TSCI區(qū)域進行TUNEL染色后發(fā)現(xiàn)實驗組損傷區(qū)域TUNEL陽性細胞與對照組相比明顯減少，實驗組SCI模型的運動功能得到了很大改善。文獻[27]將轉(zhuǎn)染了miR-21基因的BMSCs-Exo進行體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)富含miR-21的Exo在體外能夠抑制人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y cells）中程序性細胞死亡蛋白4（PDCD4）和張力蛋白同源物（PTEN）的表達，在TSCI模型鼠中也觀察到了PDCD4和PTEN 表達量的下降，并且PTEN下游PI3K非依賴性和PI3K依賴性信號通路被激活，促進了髓鞘的形成和軸突的再生。所以，MSCs-Exo能夠通過調(diào)整SCI損傷部位微環(huán)境中不同成分的含量抑制神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)功能恢復。

2.2 抑制神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細胞增生

TSCI后A1型神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細胞增生，并大量分泌硫酸軟骨素蛋白多糖、壓迫損傷部位、抑制軸突再生[28-29]，同時，分泌大量促炎介質(zhì)，如白三烯、腫瘤壞死因子ɑ（tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ）、降鈣素基因相關(guān)肽calcitonin gene related peptide， CGRP）等增強感覺神經(jīng)末梢傷害性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放， 嚴重影響神經(jīng)功能恢復[30]。 文獻[6]1 543將BMSCs-Exo注射到模型鼠體內(nèi)，觀察到A1型膠質(zhì)細胞比例、星形膠質(zhì)細胞中p65陽性細胞核百分比和前角TUNEL陽性細胞百分比均出現(xiàn)下降，病變面積縮小，TNF-ɑ、白細胞介素-1α （interleukin-1ɑ，IL-1ɑ）和IL-1β表達量減少，髓鞘堿性蛋白、突觸素和神經(jīng)元核表達增加，模型鼠的BBB評分提高和斜板角度增大，因此推測BMSCs-Exo通過抑制星形膠質(zhì)細胞NFκB的核轉(zhuǎn)位減少了TSCI后A1型神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量，促進了TSCI修復。文獻[11]477通過同樣的方法將MSCs-Exo注射到模型鼠體內(nèi)后也觀察到A1神經(jīng)毒性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的激活被抑制，運動功能得到了明顯改善，不僅如此，還發(fā)現(xiàn)毒性星形膠質(zhì)細胞增生被抑制后TSCI部位膠質(zhì)瘢痕的形成減少，神經(jīng)再生增強。因此，抑制神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細胞增生，減少膠質(zhì)瘢痕形成是MSCs-Exo促進TSCI修復的又一重要作用。

2.3 免疫調(diào)節(jié)

免疫系統(tǒng)是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要部分，一直以來都是研究的重點。將臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體 （UMSCs-Exo） 通過尾靜脈注射到TSCI小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)損傷部位的促炎性M1型巨噬細胞的數(shù)量和促炎細胞因子如 TNF-ɑ、IL-6、Interferon-β（IFN-β）、Granulocyte colony-stimulating factor、Monocyte chemoattractant protein-1和Macrophage inflammatory protein 1ɑ明顯減少，而抗炎性M2型巨噬細胞的數(shù)量和抗炎細胞因子如IL-4和IL-10 明顯增加[31]。在另一個研究中將BMSCs-Exo通過尾靜脈注射到TSCI小鼠體內(nèi)，免疫熒光檢測顯示損傷部位促炎型細胞因子如TNF-ɑ、IL-1ɑ、IL-1β和P65明顯下調(diào)，減弱了對A1型毒性星形膠質(zhì)細胞的活化，從而保護神經(jīng)元、軸突和髓鞘[6]1 545。進一步將DIR熒光標記的BMSCs-Exo注入模型鼠體內(nèi)，在注射后3h、24h分別檢測損傷部位的熒光信號，發(fā)現(xiàn)損傷部位的M2型巨噬細胞胞質(zhì)中高熒光信號，而AS、M1型巨噬細胞等均未檢測到熒光信號，并且在小鼠的脾臟中也檢測到了熒光信號，1周后稱量脾臟發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠脾臟的質(zhì)量比陰性對照組脾臟的質(zhì)量減輕了18%，這些結(jié)果表明免疫細胞以及免疫器官在MSCs-Exo介導的TSCI修復中發(fā)揮了巨大作用[22]58。

2.4 恢復BSCB完整性

創(chuàng)傷性脊髓損傷后BSCB的完整性遭受嚴重破壞，各種炎癥因子和炎癥細胞進入損傷區(qū)域，加速神經(jīng)細胞和少突膠質(zhì)細胞的死亡，擴大脊髓的損傷范圍[32]。文獻[17]5將BMSCs-Exo通過尾靜脈注射到模型鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)BMSCs-Exo能夠抑制BSCB周圍周細胞內(nèi)NF-kB信號通路的激活，抑制周細胞的脫落和遷移，導致BSCB的通透性降低，模型鼠BBB評分與對照組相比明顯提高，說明BMSCs-Exo能夠保護損傷后BSCB的完整性，減輕損傷部位炎癥反應(yīng)，有利于運動感覺功能恢復。

3 結(jié)語

MSCs-Exo治療TSCI展現(xiàn)出良好的療效，MSCs-Exo不僅具有極低的免疫原性、易穿過BSCB，而且能夠克服細胞移植存在的致瘤等風險。但該方法也存在很多不足，一方面，MSCs-Exo的最佳移植時間以及移植劑量等仍需探究;另一方面，MSCs產(chǎn)生Exo的效率比較低（106個MSCs每天可產(chǎn)生1～4μg Exo蛋白）[33]，而且經(jīng)胰蛋白酶消化傳代15次以上的MSCs明顯出現(xiàn)功能減退，表現(xiàn)為分泌Exo的量和Exo中含有的成分都出現(xiàn)變化。并且MSCs-Exo靶向性差，Exo的有效成分利用率低[34]，針對MSCs-Exo產(chǎn)量低、靶向性差，目前已有研究，如文獻[35]用氧化鐵納米顆粒（IONP）預處理人間充質(zhì)干細胞（Human Mesenchymal Stem Cells，HMSCs）制備了仿外泌體納米微囊（NV-IONP），不僅使治療性生長因子分泌增加，而且能夠充當磁導導航工具，實現(xiàn)NV-IONP的靶向輸送，增加治療性生長因子在脊髓損傷部位的濃度，提高損傷修復能力?？傊?，MSCs-Exo為TSCI的治療帶來了曙光，有很好的研究前景和巨大的研究價值。

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（責任編輯：丁 寒，吳曉紅）