分析血清外泌體miRNAs在急性腦梗死診斷中的應用

付坤，劉華強，王健，王法臣，韓良波，王同新

濰坊市益都中心醫院神經外一科，山東青州 262500

急性腦梗死（ACI）神經功能性疾病，局部腦組織缺氧缺血是其致病機制，經緊急救治后，仍有45%左右的殘疾病死率，對人們有生命威脅，需早診治早預防[1]。急性腦梗死，診斷方式多樣，其中卒中量表評分能對急性腦梗死者神經功能缺損程度進行評估，CT、磁共振成像等能對腦梗死區域做出準確觀察，可明確腦血管堵塞情況。但急性腦梗死早期影像學特征不明顯，很難將缺血病灶準確地展示出來，而磁共振成像則有使用禁忌，對此，需尋求更敏感的診斷指標，以便抓住ACI者的治療時機[2]。血清外泌素miRNAs近年得到重視，若存在腦梗死情況，會增加miRNAs表達水平，且此檢查無創傷性，便于急性腦梗死者進行重復檢測，外泌素miRNAs較高的穩定性，能提高ACI者的診斷準確率[3]。故研究對80例ACI者、80名健康對照者進行觀察，旨在評估血清外泌體miR-20b-5p的診斷價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究所選病例經過倫理委員會批準。研究所觀察的樣本是80例ACI者，80名健康對照者，分別歸納為研究組和對照組，研究組：急性腦梗死發病時間6～61 h，平均（34.28±2.91）h；年齡47～72歲，平均（59.63±3.26）歲；男42例，女38例。對照組：年齡46～73歲，平均（60.14±3.59）歲；男43名，女37名。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標準：研究組：納入者均與全國第四屆腦血管學術會議制度的腦梗死診斷標準相符合，且納入者均行CT、MRI檢測，圖像特征和急性腦梗死相同。腦梗死發病時間在72 h內，且為原發性腦梗死；納入者或家屬在同意書上簽字。對照組：體檢結果均正常。

排除標準：短暫性腦缺血者；有惡性腫瘤者；有其他腦出血疾病者；有腦外傷、感染性疾病者、嚴重系統性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌體提取及RNA測定 納入者均行血清外泌體miRNA提取檢測，納入者均行5 mL靜脈血的抽取，在恒溫箱中行30 min的放置后，在4℃的冰箱中保存2 min，離心樣本后，轉移上清液至兩個試管中并標記，對樣本行二次離心處理，在EP管中放置上清液，保存在－80℃的冰箱中，后在樣本中加入63μl溶液，均勻混合后，在4℃的環境中過夜，后對樣本行3次離心處理。對樣本行醋酸雙氧鈾水溶液染色處理，對外泌體形態進行觀察，后經納米顆粒跟蹤技術對外泌體體積進行相應測定，后經CD9抗體、TSG101抗體、羊抗鼠等對納入者外泌體蛋白標志物進行檢測。各檢測措施完成后，根據試劑要求，在冰面上放置提取的外泌體RNA，后經紫外線對其0D260/0D280值進行相應計算，以計算結果對RNA純度、濃度進行測定。

1.2.2 miRNA檢測cDNA擴增處理經All-in-oneTMmiRNA qPCR Ki實施，此過程中反應試劑主要有無RNA酶 水3.6μl、All-in-oneTMmiRNA qPCR Primer2 μl、ROX Reference Dye 0.4μl等，在95℃下對樣本行10 min的預變性處理，在完成40個循環后，行10 s的再次變性，后調整溫度至60℃，保持20 s后，提高溫度至72℃，對其行10 s的延伸處理即可。

1.3 觀察指標

觀察兩組血清外泌體miR-20b-5ps情況。

1.4 統計方法

采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據，非連續性變量表達方式為中位數和四分位數間距，組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體觀察結果

外泌體以球形結構為特征，直徑在100 nm左右；經分離處理后，外泌體體積在98 nm左右，CD63、CD81、CD9為外泌體常見陽性標志物。見圖1。

圖1 血清外泌體測定結果

2.2 miR-20b-5p相對表達量觀察

miR-20b-5p相對表達量在研究組是3.68，1.57～12.48為其四分位數間距，而miR-20b-5p相對表達量在對照組是1.041，0.52～1.81為其四分位數間距，miR-20b-5p相對表達量研究組比對照組高，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖2。

圖2 兩組miR-20b-5p相對表達量

3 討論

既往臨床對外泌體認識不足，被當做是細胞進行廢物排泄的工具，然而研究深入后發現，在細胞精密調控下，外泌體才會得到生產和釋放。外泌體來源內細胞多泡體，在其形成、轉移、釋放中參與的蛋白較多，有RAB、ESCRT等，外泌體大小、內容物及表面受體的區別和細胞來源有相關性[4]。經釋放后，外泌體在精液、血清等體液中均有分布，且能經血液向全身組織進行轉移擴散。在炎癥反應、機體損傷等因素下，外泌體會呈聚集性分布，而在卒中模型研究中，可觀察到腦缺血病灶會出現強烈攝取外泌體的情況，且持續在缺血區域出現，濃度始終保持在較高水平，若機體健康無損傷，外泌體濃度會呈明顯下降趨勢[5]。

歷年研究發現，經蛋白質、微小核酸核糖等物質，外泌體會對血管形成產生影響，且膠質細胞、神經系統有所改變，在腦梗死重塑過程中有明顯的參與。細胞微小核酸核糖蛋白質、信使RNA等均是外泌體來源，在急性腦梗死進展中，會有蛋白質、RNAs轉移的情況，對其神經、血管及膠質細胞產生影響，對急性腦梗死者細胞通信功能進行調節，從而作為腦梗死診治的重要指標[6]。此外，miRNA還能對急性腦梗死者預后進行判斷，屬潛在生物指標，其預測機制是miRNA會參與腦缺血的修復過程[7]。此外，miRNA被臨床歸納為內源性單鏈非編碼小分子RNA，其特點除核苷酸含量多以外，還有較高的保守度，能結合靶向mRNA者的非翻譯區，從而對急性腦梗死者生物過程進行調節。腦梗死病理進展多樣，有粥樣動脈硬化、斑塊破裂、細胞凋亡等，然miRNA在各病理過程中均發揮參與作用，且能對血管生成、少突膠質生成等發揮促進作用，使其后腦能得到重塑[8]。

miRNA分布廣泛，除在細胞內含量高以外，在體液中也有較高含量，由于其外部存在脂蛋白或外泌體，故有較高的穩定性和生物特異性，其濃度會隨疾病出現明顯的變化，有敏感度高、特異度高的特點，且檢測過程較簡單，能對急性腦梗死者做出準確的判斷[9-10]。外泌體對急性腦梗死者的影響，主要體現在miRNA的傳遞，其能自由通過血腦屏障，且有較高的穩定性，能對腦梗死進展過程進行影響。有研究發現，血清外泌體于急性腦梗死者而言，miRNA表達會出現較大變化，其中增長趨勢明顯的即是促癌miRNA。在該研究的檢測中，miRNA始終有外泌體的保護，能對血液RNA酶的降解進行預防，使其穩定性提高，且其介導細胞通訊功能，可對靶細胞基因表達進行抑制[11]。而在急性腦梗死者的各項檢查中，外泌體miRNA檢測有無創傷的特點，僅經血液樣本獲取便能進行檢測，重復性強，敏感度高，經濟性高，相比傳統活檢、CT、MRI等更值得使用[12]。經血清外泌體miRNAs的檢測后可發現，miR-20b-5p相對表達量在研究組比對照組高。此研究結果表明，miR-20b-5p能對急性腦梗死做出相對準確的判斷，以其數值為依據，還能對急性腦梗死的進展進行預測，繼而對治療措施進行調節，使急性腦梗死者預后改善。

綜上所述，急性腦梗死病理特征明確，經血清外泌體miRNAs能對其做出準確的判斷，可為急性腦梗死預防、診治提供參考。